Une méthode d’analyse cellulaire pour le Condyle mandibulaire murin et morphométriques

L’objectif général de cette expérience est d’observer les effets de la charge compressive dans le cartilage condylien mandibulaire de souris à l’aide de mesures morphométriques dans les radiographies et l’analyse histologique. Ces mesures peuvent aider à répondre à des questions clés concernant les changements structurels et cellulaires dans le condyle de la mandibule des rongeurs. Le principal avantage de la technique présentée ici est qu’elle pourrait être utilisée pour analyser d’autres animaux de petite taille ou participants.

Pour ce protocole, ayez des mandibules de souris isolées et disséquées prêtes à l’emploi. Sur une boîte de Pétri, transférez les mandibules dans un système de boîte à rayons X. Ensuite, prenez des radiographies à 26 kilovolts pendant cinq secondes.

Maintenant, ouvrez les images dans le logiciel d’analyse pour effectuer des mesures morphométriques. Tout d’abord, utilisez le bouton de l’unité pour configurer la barre d’échelle. Ensuite, sélectionnez six points anatomiques à l’aide du marqueur de style 2.

Tout d’abord, sélectionnez les points les plus postérieurs du condyle mandibulaire comme point un. Ensuite, sélectionnez le processus incisé pour le point deux. Ensuite, sélectionnez le point le plus profond au niveau de l’encoche sigmoïde pour le point trois.

Ensuite, sélectionnez le point le plus profond dans la concavité de la branche mandibulaire, le point quatre, puis le point le plus antérieur de la surface articulaire condylienne, le point cinq. Maintenant, sélectionnez le point le plus postérieur de la surface articulaire condylienne comme point six et procédez à la prise de mesures de longueur à l’aide de l’outil de longueur. Ensuite, utilisez l’outil de ligne perpendiculaire à partir des points trois à quatre pour mesurer la longueur de la tête du condyle, qui est la longueur de la perpendiculaire, du point un à la ligne entre les points trois et quatre.

Ensuite, mesurez la longueur mandibulaire, entre les points un et deux. Enfin, mesurez la largeur de la tête du condyle, qui se situe entre les points cinq et six. Pour enregistrer les données, copiez la liste des mesures sur le côté droit de l’écran.

Avant d’intégrer les mandibules fixes, mais non décalcifiées, faites-les tremper toute la nuit dans du saccharose à 30 pour cent dans du PBS. Le lendemain, disséquez tout excès de tissu mou et coupez soigneusement le condyle mandibulaire. Maintenant, placez les échantillons dans des moules en plastique, avec la surface médiale du condyle contre la base du moule et l’échantillon parallèle au fond du moule.

Ensuite, immergez-les dans de la résine d’enrobage et refroidissez la résine avec un morceau de glace sèche. Ensuite, complétez les moules avec plus de résine d’enrobage. Transférez-les dans du bicarbonate de méthyle froid, refroidi au congélateur ou à la glace sèche.

Une fois refroidis, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius pour la section. Pour quantifier l’expression de Col10a1 dans le MCC des coupes sagittales des condyles, ouvrez les images histologiques dans un logiciel d’analyse d’images et sélectionnez la zone d’intérêt à l’aide de l’outil lasso. Dans ce cas, la région MCC est sélectionnée.

Notez le nombre de pixels dans la zone, qui est indiqué dans la boîte de l’histogramme. Ensuite, sélectionnez les pixels rouges Col10a1 en ajustant la gamme de couleurs. Utilisez l’outil pipette pour sélectionner un pixel rouge dans l’image et cliquez sur OK. Ensuite, enregistrez le nombre de pixels rouges dans la zone, comme indiqué dans la boîte de l’histogramme.

La fraction de pixels rouges dans la zone représente la quantité d’expression Col10a1. Maintenant, en utilisant la même technique de base, quantifiez l’activité de TRAP dans le MCC et l’os sous-chondral. Tout d’abord, sélectionnez le cartilage dans les régions osseuses sous-chondrales comme zones à analyser et notez le nombre total de pixels.

Ensuite, sélectionnez les pixels jaunes générés par le substrat ELF97. Notez le nombre de pixels positifs et calculez la fraction de pixels positifs TRAP. Maintenant, quantifiez les cellules positives à l’EDU qui sont contre-colorées en bleu par le DEPI.

Encore une fois, sélectionnez la zone d’intérêt, puis quantifiez les pixels bleus qu’elle contient. Utilisez également cette méthode pour déterminer le nombre de pixels positifs EDU dans la même région. Des mesures morphométriques de souris, soumises à une charge compressive de l’ATM, ont montré que la charge augmentait significativement la longueur de la mandibule et de la tête du condyle.

Néanmoins, la charge n’a pas entraîné de changement significatif de la largeur du condyle. La quantification de la distribution du collagène a révélé une augmentation significative de l’expression de Col10a1 et du MCC des condyles des animaux chargés. D’autre part, l’expression de Col2a1 n’était pas très différente de celle du contrôle.

L’activité de TRAP a augmenté dans la région sous-chondrale des condyles et des souris chargées, tout comme la sous-prolifération. La coloration EDU indique le nombre de cellules prolifératives. La distribution des protéoglycanes dans le MCC a été quantifiée en évaluant la zone colorée au bleu de toluidine et la carte de distance.

Il y a eu une augmentation significative de la cartographie de la distance dans le MCC des condyles du groupe chargé. Cependant, la zone colorée au protéoglycane n’était pas statistiquement différente entre les groupes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les changements cellulaires et structurels dans le condyle mandibulaire des rongeurs.