Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

L’objectif global de ce protocole analytique est d’extraire et de quantifier simultanément les deux médicaments anticancéreux Doxorubicine et Mitomycine C, co-délivrés par des nanoparticules hybrides polymère-lipide, et le métabolite de la doxorubicine, le doxorubicinol, dans des matrices biologiques à l’aide d’une méthode simple et robuste de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanomédecine, telles que la conception d’un système de nanoportage efficace basé sur la nanopharmacocinétique des combinaisons de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier simultanément trois composés médicamenteux dans la même matrice biologique, sans qu’il soit nécessaire de modifier la phase mobile de la HPLC.

Ainsi, cette méthode peut donner un aperçu des comportements biologiques de la doxorubicine, de la mitomycine C et du doxorubicinol dans les tumeurs mammaires primaires. Il peut également être appliqué à d’autres types de cancer traités avec des médicaments similaires. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes efficaces de préparation des échantillons sont difficiles à apprendre.

Pour commencer cette procédure, collectez et congelez le sang total, les principaux organes et la tumeur du sein, comme indiqué dans le protocole de texte. Pesez rapidement les tissus congelés et notez le poids sur le carnet de notes de laboratoire. Ensuite, transférez-les dans un tube conique à fond rond de 13 millilitres.

Ensuite, ajoutez entre un et cinq millilitres de tampon Cell Lysis glacé. À l’aide d’un homogénéisateur manuel électrique, homogénéisez le tissu avec un mouvement de haut en bas sur de la glace à 18 000 tr/min. Après cela, lavez la sonde du générateur de dents de scie de 10 millimètres de l’homogénéisateur avec de l’eau désionisée distillée.

Lavez la sonde avec de l’éthanol à 70 %, puis à nouveau avec de l’eau distillée désionisée. Transférez 50 microlitres d’homogénat de tissu ou de sang total dans un tube de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’un étalon interne de 2 000 nanogrammes par millilitre de 4-méthylombelliférone.

Ajoutez un solvant d’extraction à froid glacé contenant 150 microlitres d’acétonitrile et 100 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq millimolaires. Agiter vigoureusement le mélange pendant deux minutes. Centrifuger à 3 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après cela, transférez 200 microlitres de surnageant dans un tube à microcentrifuger frais et pré-refroidi. Utilisez un lent courant d’azote gazeux pour évaporer le surnageant à 60 degrés Celsius avec une protection contre la lumière. Ensuite, reconstituez le résidu séché avec 100 microlitres de méthanol glacé.

Agitez vigoureusement pendant 30 secondes. Centrifuger à 3 000 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un insert de flacon HPLC.

Placez les flacons d’échantillon dans un plateau d’échantillonneur automatique pour injection. Pour commencer, préparez la phase mobile HPLC comme indiqué dans le protocole texte. Réglez les conditions initiales de la composition de la phase mobile à 16,5 % H2O et 83,5 % acétonitrile.

Réglez le débit isocratique à 1,0 millilitres par minute. Ensuite, séparez les médicaments à l’aide de la condition de phase mobile gradient comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, réglez le détecteur UV sur deux canaux : l’un à 310 nanomètres pour l’étalon interne 4-méthylombelliférone et l’autre à 360 nanomètres pour la mitomycine C.Après cela, réglez le premier canal du détecteur de fluorescence sur une longueur d’onde d’excitation de 365 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 445 nanomètres pour la 4-méthylombelliférone.

Réglez le deuxième canal sur une longueur d’onde d’excitation de 480 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 560 nanomètres pour la doxorubicine et le doxorubicinol. Pour commencer, utilisez l’échantillonneur automatique pour injecter 15 microlitres de l’échantillon. La composition de la phase mobile à gradient programmé change automatiquement en augmentant la composition de l’acétonitrile de zéro à 18 minutes.

Après 18 minutes, la condition de la phase mobile est rétablie à l’état initial et rééquilibrée pour l’injection suivante. Après l’analyse de chaque échantillon, notez les pics des composés médicamenteux et leurs temps de rétention. Ensuite, utilisez le logiciel HPLC pour intégrer la zone du pic sous la courbe pour les composés médicamenteux.

Calculer le pourcentage de récupération du médicament et le rapport de l’aire sous la courbe entre chaque composé médicamenteux et l’étalon interne, comme indiqué dans le protocole textuel. Dans cette procédure, deux médicaments anticancéreux, la doxorubicine et la mitomycine C, ainsi que le métabolite de la doxorubicine, le doxorubicinol, sont détectés sans interférence biologique. L’analyse HPLC montre que chaque médicament est bien séparé des autres.

La méthode HPLC développée présente une variation de moins de 15 % de la précision et de l’exactitude intra et interjournalières pour chacun des médicaments étudiés, à la fois dans le sang total et dans diverses matrices biologiques, ce qui indique une excellente reproductibilité. La pharmacocinétique et la biodistribution de l’administration conjointe de la doxorubicine et de la mitomycine C à base de nanoparticules longues circulantes ou pégylées sont ensuite déterminées. Dans le sang, les concentrations de médicaments délivrées par les nanoparticules hybrides polymère-lipide au fil du temps sont au moins six fois plus élevées que dans les solutions médicamenteuses libres équivalentes.

Dans une tumeur mammaire orthotopique, les nanoparticules hybrides polymère-lipide peuvent co-administrer la doxorubicine et la mitomycine C à leur rapport médicamenteux synergique. Par rapport à la solution médicamenteuse libre, les nanoparticules présentent une accumulation accrue de tumeurs. Cela est dû à la circulation systématique prolongée, qui permet aux nanoparticules d’exploiter les effets de perméabilité et de rétention améliorés de la tumeur.

Une formation quantitative supplémentaire de doxorubicinol dans la tumeur du sein sur 24 heures, ainsi qu’une apoptose tumorale améliorée, indiquent que la biodisponibilité du médicament est essentielle dans la conception d’une formulation efficace de nanoparticules. En utilisant cette méthode HPLC, il a été démontré avec succès que les nanoparticules hybrides polymère-lipide peuvent délivrer avec précision une combinaison de médicaments synergiques dans les cellules cancéreuses in vivo, conduisant à une meilleure chimiothérapie. Cette technique peut être réalisée en deux heures environ si elle est exécutée correctement.

Pour minimiser la déprédation potentielle de la drogue, il est important de ne pas oublier d’éviter la lumière directe du soleil et de garder l’échantillon sur de la glace pendant la tentative de cette procédure. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la nanomédecine pour explorer la nanopharmacocinétique de la combinaison de médicaments et pour mieux concevoir la formulation efficace de nanoparticules pour le traitement du cancer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment extraire et détecter simultanément la doxorubicine, la mitomycine C et le métabolite de la doxorubicine, le doxorubicinol, sur une large gamme d’échantillons biologiques contenant des nanoparticules chargées de la combinaison de médicaments.

N’oubliez pas que travailler avec des médicaments anticancéreux et de l’acide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions de sécurité telles que le port de gants, de lunettes de protection et de blouses de laboratoire doivent toujours être appliquées lors de l’exécution de ce protocole.