Chip à base de culture cellulaire tridimensionnelle dans perfusé micro-bioréacteurs

Bonjour, je suis Eric Gottwald et je suis chercheur scientifique à l'Institut des interfaces biologiques de l'Institut de technologie Ware. Aujourd'hui, je souhaite vous présenter notre système microbionique perfusé basé sur une puce. Avant de pouvoir utiliser la puce dans des applications de culture cellulaire, nous devons hydrolyser le polymère et débloquer la zone microstructurée.

Cela s'obtient en immergeant simplement la puce dans différentes concentrations d'isopropanol, en commençant par 100 %. On plonge la puce quelques secondes dans chaque concentration, et la dernière étape consiste simplement en de l'eau. Ensuite, la puce est séchée, puis doit être recouverte d'une solution de collagène I pour faciliter l'adhésion des cellules au polymère. Cette opération est réalisée en déposant quelques gouttes d'une solution de collagène I sur la zone microstructurée, puis la puce est incubée à quatre degrés Celsius toute la nuit.

Après l'incubation nocturne avec la solution de collagène I, la solution est retirée et la puce est lavée avec du PBS stérile. Ensuite, le PBS est également retiré et la puce est désormais prête pour l'inoculation des cellules. Nous allons maintenant inoculer la puce cellulaire avec une suspension de cellules isolées, en déposant simplement 150 microlitres de suspension cellulaire sur la zone microstructurée. Après le dépôt des cellules, la puce est incubée pendant trois heures à 37 degrés dans un incubateur.

Après une période d'incubation de trois heures, la puce est retirée de l'incubateur et est désormais prête à être insérée dans l'ector. Pour cela, l'ector est sorti de son emballage stérile et la stérilité est obtenue par irradiation gamma de cette feuille transparente. Nous devons donc simplement ouvrir l'emballage et retirer l'ector.

Ce que nous allons faire ensuite consiste à insérer le haut de la bouteille dans ce réservoir de milieu afin de pouvoir désassembler le boîtier du bioréacteur pour l'insertion de la puce. Après avoir ouvert le boîtier du bioréacteur, nous pouvons maintenant insérer la puce, ce qui s'effectue simplement en plaçant la puce dans la rainure du boîtier du bioréacteur, puis le bioréacteur peut être réassemblé. Ce que nous devons faire enfin est de relier deux filtres stériles au réservoir de milieu et un port d'échantillonnage stérile.

Pour mesurer la tension d'oxygène réelle dans la boucle de circulation fermée, nous insérerons deux capteurs d'oxygène en les montant simplement entre ces deux raccords. Le bactor est désormais prêt à être rempli avec le milieu de culture. Le système bactor est maintenant prêt à être rempli avec le milieu de culture cellulaire, ce qui s'obtient en raccordant simplement la boucle de circulation fermée à la pompe péristaltique.

De cette manière, nous allons simultanément réduire le débit de toute la circulation du bactor. Comme vous pouvez le voir ici dans la fenêtre Ector, vous pouvez observer le milieu montant depuis le bas, toujours plus haut, et quittant le bactor par le haut. Avant de placer le système Bactor dans l'incubateur, nous vérifions le remplissage sans bulles de la boucle de circulation.

Le système est désormais entièrement rempli de milieu de culture cellulaire et nous pouvons transférer le bioréacteur dans l'incubateur. Nous allons maintenant placer le bioréacteur dans la chambre d'incubation. Pour cela, le bioréacteur est tout d'abord relié à la pompe péristaltique, comme vous l'avez déjà vu brièvement auparavant, et le bioréacteur est désormais perfusé activement par ce milieu provenant du flacon.

Et pour maintenir la concentration ambiante en oxygène, nous relions le réservoir de milieu à l’alimentation en gaz. Enfin, nous allons connecter deux capteurs d’oxygène au circuit afin de surveiller en continu la tension en oxygène dans le système. Le montage est désormais terminé et peut fonctionner aussi longtemps que vous l’avez prévu pour l’expérience.

L'un des outils les plus puissants lors de l'analyse des fonctions organotypiques des cellules à l'intérieur des conteneurs MicroCon est le microscope à balayage laser, que vous pouvez voir ici. Le microscope à balayage laser nous offre la possibilité d'observer chaque conteneur MicroCon individuel sans destruction. Et puisque les conteneurs MicroCon ou la puce peuvent être utilisés avec des méthodes classiques de coloration immunohistochimique et d'immunofluorescence, nous sommes en mesure de détecter toutes sortes de marqueurs et de fonctions organotypiques à l'intérieur des micro-conteneurs.

Comme vous pouvez le voir ici dans l'animation de cette puce, le fond est entièrement rempli de cellules ainsi que les parois du conteneur MicroCon. Nous disposons d’un grand nombre de cellules bien vivantes, et très, très peu de cellules mortes. L'image suivante vous montre que nous pouvons détecter toutes sortes de fonctions organotypiques à l'intérieur du conteneur MicroCon.

Par exemple, pour les hépatocytes, la production d'albumine ou l'expression d'E pouvait être détectée dans les cellules, ce que l'on observe clairement ici en superposition. Les noyaux sont colorés en bleu. L'eco est coloré en vert, et l'albumine est exprimée ou colorée en rouge.

Et comme vous pouvez le constater ici clairement, toutes les fonctions organotypiques que l'on attend des hépatocytes sont bien exprimées dans ce type de culture en 3D. De plus, nous avons examiné un autre marqueur d'hépatocyte, la cytokeratine 18, et cette image montre que la cytokeratine 18 est également bien exprimée dans ce type de cultures. Cela vous convaincra, espérons-le, que ce type de fonctions organotypiques pourrait également être utile pour d'autres cultures organotypiques.

À la fin de l'expérience Biore, la puce peut être utilisée pour l'isolement de toutes sortes de composants cellulaires, comme par exemple l'ARN total. Comme vous pouvez le voir ici, nous vous montrons l'ARN total récupéré, qui a été isolé à partir du système de bioréacteur. Cet ARN total peut ensuite être utilisé pour des applications en aval, comme par exemple la PCR en temps réel, ou comme vous pouvez le voir ici, l'analyse par puces à ADN.

De plus, des cellules intactes peuvent être isolées à partir du système, puis utilisées pour une analyse classique par cytométrie en flux. Comme vous pouvez le voir ici, j'espère que nous avons pu vous montrer que le système pourrait être utile pour toutes sortes d'applications nécessitant des réactions organotypiques, ainsi que pour tous ces types d'applications que nous n'avons pas encore envisagés, comme par exemple, les applications impliquant les cellules souches.