Un test Simple et peu coûteuse pour mesurer la déambulation dans des modèles murins de la dystrophie musculaire
29 décembre 2017
Ce protocole décrit un système flexible et peu onéreuse pour mesurer ambulation de souris en un dosage de l’activité de plein champ. Nous montrons qu’un test de marche de 6 minutes basé sur ce système détecte une diminution des mouvements volontaires chez la souris mdx et distingue précisément amélioration à un sauvetage d’un muscle spécifique de ces animaux.
L'objectif général de ce test est de mesurer la locomotion volontaire chez des modèles murins de dystrophie musculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dystrophie musculaire concernant l'évolution de la faiblesse musculaire chez les modèles murins de dystrophie musculaire, ainsi que l'efficacité de thérapeutiques potentielles. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une mesure non invasive et reproductible de l'activité animale qui peut être facilement adaptée à de nombreux contextes de recherche différents.
Dans une pièce calme à température contrôlée et à un moment cohérent de la journée, placez une caméra sur une grille métallique au-dessus de la chambre d'activité afin d'enregistrer l'ensemble de l'arène, puis nettoyez la chambre avec un désinfectant. Juste avant l'enregistrement de l'activité, laissez la souris saisir la barre du dynamomètre numérique, puis tirez doucement vers l'arrière jusqu'à ce que la barre soit relâchée. Enregistrez la tension maximale en newtons pour chaque essai.
Avec une minute de repos entre chaque essai. Immédiatement après le test de force de préhension, placer la souris dans la chambre et démarrer l'enregistrement vidéo, en lui permettant d'explorer librement. Après six minutes, arrêter l'enregistrement et replacer la souris dans sa cage d'origine.
Pour l'analyse de suivi des données vidéo, ouvrez d'abord l'enregistrement dans le logiciel de montage vidéo approprié et réglez la vitesse sur deux fois. Exportez la vidéo réduite au format de fichier mp4 pour l'analyse de suivi, puis ouvrez la vidéo dans le logiciel d'analyse vidéo adéquat. Pour définir l'étalonnage de l'enregistrement vidéo, utilisez l'outil de ligne afin de tracer une ligne le long d'un côté de la chambre.
Cliquez avec le bouton droit sur la ligne, sélectionnez « étalonner la mesure », puis saisissez la taille réelle du côté de la chambre en centimètres. Pour commencer le suivi semi-automatisé de la position de la souris, cliquez sur le curseur de déplacement. À partir de l'image initiale de la vidéo, cliquez avec le bouton droit sur le point à suivre.
Le point de suivi sera marqué par un cercle bleu. Utilisez la flèche droite du clavier pour avancer d'une image. Le point de suivi doit se déplacer automatiquement en fonction de la position de la base de la queue.
Si la position de suivi n'est pas alignée avec le point d'intérêt dans une image donnée, alignez manuellement le cercle bleu avec la position de suivi. Une fois que la totalité de la vidéo aura été suivie, enregistrez la vidéo et la superposition du tracé, puis sélectionnez « exporter vers un tableur » pour exporter les données de position du tracé. Conformément aux résultats rapportés à partir d'essais similaires, les souris mdx, dépourvues de dystrophine et soumises à un protocole d'exercice immédiatement avant le test, présentent une activité volontaire significativement moindre lors d'un test en champ ouvert de six minutes, par rapport aux animaux de type sauvage.
En effet, après l'effort modéré d'un test de force de préhension, les souris mdx restaient généralement immobiles pendant les premières minutes du protocole d'ambulation, avec une augmentation modeste de leur mouvement entre la quatrième et la cinquième minute. Toutefois, lorsqu'on compare les animaux de type sauvage et les animaux mdx sans défi d'exercice, aucune différence n'est détectée concernant la distance parcourue. Les souris mdx transgéniques exprimant l'utrophine sont indistinguables des animaux de type sauvage, sans différences significatives dans la distance totale parcourue, ni à aucun des points temporels cumulatifs observés.
Pour déterminer l'effet d'une diminution du taux d'échantillonnage, la distance totale parcourue sur une minute de vidéo à cadence maximale a été mesurée, puis comparée aux mesures de distance obtenues à partir de versions sous-échantillonnées du jeu de données. Réduire la fréquence d'images de moitié a diminué la distance mesurée de 5 % par rapport à la distance initiale calculée. La précision de la distance mesurée chute fortement au-delà de ce point, bien que même des jeux de données fortement décimés reproduisent encore étroitement le trajet de l'animal, ce qui souligne l'importance de prendre en compte la fréquence d'images et le traitement du signal lors de l'évaluation de l'activité animale, et démontre qu'une haute résolution spatiale peut être conservée dans des données vidéo sous-échantillonnées.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enregistrer et analyser la locomotion de la souris dans un environnement de champ ouvert. Une fois maîtrisée, cette analyse peut être réalisée en 15 à 30 minutes si elle est effectuée correctement. Ce test peu coûteux et non invasif permet aux chercheurs d'examiner l'activité motrice chez des modèles murins de dystrophie musculaire, et peut constituer une première étape informative avant des mesures fonctionnelles plus approfondies.
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Aperçu
Ce protocole décrit un système souple et peu coûteux permettant de mesurer la locomotion de la souris dans un test d'activité en champ ouvert. La méthode fournit une mesure non invasive et reproductible de l'activité animale, qui peut être adaptée à divers contextes de recherche.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur la dystrophie musculaire
- Analyse comportementale
Contexte
- Le test mesure l'ambulation volontaire chez des modèles murins de dystrophie musculaire.
- Il répond à des questions essentielles concernant la progression de la faiblesse musculaire.
- La technique est conçue pour évaluer l'efficacité de thérapeutiques potentielles.
- L'enregistrement est effectué dans un environnement contrôlé afin d'assurer la reproductibilité.
Objectif de l'étude
- Mesurer le mouvement volontaire chez les souris mdx.
- Évaluer l'impact d'interventions spécifiques aux muscles.
- Fournir des informations sur la progression de la dystrophie musculaire.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une caméra positionnée au-dessus de la chambre d'activité pour l'enregistrement.
- Nettoyage de la chambre avec un désinfectant avant les essais.
- Permettre à la souris de s'accrocher à une barre verticale afin de mesurer la tension maximale.
- Enregistrement de l'activité au cours d'un test de déambulation de 6 minutes.
Résultats principaux
- Le système détecte les diminutions des mouvements volontaires chez les souris mdx.
- Il distingue précisément les améliorations dues à la récupération spécifique du muscle.
- Les résultats sont reproductibles entre différents essais.
- La méthode est adaptable à divers contextes de recherche.
Conclusions
- Cet essai est efficace pour l'étude de la dystrophie musculaire chez la souris.
- Il fournit des données précieuses sur l'efficacité de traitements potentiels.
- L'approche est souple et peut être utilisée dans divers environnements de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure de l'ambulation volontaire chez les modèles murins fournit une lecture translationnelle de la fonction motrice dans la dystrophie musculaire, directement comparable à des critères d'évaluation cliniques tels que le test de marche de 6 minutes. Cet essai peu coûteux, basé sur la vidéo, permet une évaluation reproductible et non invasive de l'évolution de la maladie et de la réponse thérapeutique dans les études précliniques. En détectant les déficits d'activité chez les souris mdx dépourvues de dystrophine et leur correction par l'expression de l'utrophine, cette méthode soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments neuromusculaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en quantifiant la locomotion volontaire comme indicateur fonctionnel de la force musculaire dans des modèles dystrophiques.
- Valeur opérationnelle : Permet la réduction des risques biologiques grâce à une corrélation reproductible entre génotype et phénotype chez des souris mdx par rapport à des cohortes sauvages et récupérées.
- Valeur prédictive : Soutient le tri du portefeuille en distinguant les interventions efficaces (par exemple, transgène d'utrophine) qui normalisent les niveaux d'activité à ceux du type sauvage.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en utilisant des métriques normalisées de locomotion en champ ouvert.
- Reproductibilité : Fournit des données quantitatives basées sur la distance et le temps, adaptables à la standardisation des essais entre différents laboratoires.
- Extensibilité : S'appuie sur des logiciels libres et open source ainsi que sur du matériel accessible pour permettre la réutilisation de la plateforme dans divers contextes de recherche, sans nécessiter d'équipement spécialisé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise des déficits de la marche pertinents pour les patients, assurant une continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique.
- Élimination des risques mécanistiques : Précise si les effets observés résultent d'une restauration spécifique du muscle ou de changements d'activité non spécifiques.
- Décisions ajustées au risque : Éclaire les critères de poursuite ou d'abandon en corrélant la récupération de la marche avec l'engagement de la cible et la modulation de la voie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, offrant un lien fonctionnel entre les mécanismes moléculaires et les résultats phénotypiques dans les modèles de dystrophie musculaire.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en reliant des interventions génétiques ou pharmacologiques à des modifications mesurables du mouvement volontaire.
- Écrans de sélection : Permet la préparation des tests grâce à un suivi reproductible basé sur la vidéo, générant des paramètres quantifiables de la marche pour l'évaluation de composés.
- Analyse : Produit des flux de données spatiales et temporelles permettant aux équipes de comparer l'activité locomotrice entre différents génotypes, traitements et points temporels.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en reproduisant les évaluations cliniques de la marche, facilitant l'alignement des biomarqueurs et la modélisation prédictive.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité reproductible et peu coûteuse pour les tests de marche, réduisant ainsi la dépendance aux plateformes spécialisées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des tests de fonction motrice.
- Valeur opérationnelle : Renforce la normalisation et la reproductibilité grâce à un suivi open source et à des conditions environnementales contrôlées.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en éliminant le besoin de systèmes coûteux de suivi des mouvements tout en préservant la qualité des données.
- Impact sur le portefeuille : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur la récupération fonctionnelle des phénotypes de marche dans les modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en enregistrement vidéo et en logiciels de suivi open source (par exemple, alignement manuel image par image).
- Dépend d'un équipement d'imagerie standard et de contrôles environnementaux constants (éclairage, température, heure de la journée).
- Exige une adhésion au protocole par toutes les équipes afin d'assurer la reproductibilité entre les sites et les opérateurs.
- Implique des adaptations selon la taille des chambres, les souches de souris et les niveaux d'activité.
- Implique des compromis entre la fréquence d'images et la précision des mesures, car le sous-échantillonnage réduit la précision du calcul des distances.
