Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

L'objectif général de la fonctionnalisation chimique de la surface des nanoparticules de HEV est de fournir une approche reproductible et constante pour la conjugaison de molécules ciblantes immunogènes, thérapeutiques et diagnostiques à la surface des nanoparticules de HEV, à des fins de diagnostic et de traitement.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanomédecine, comme la manière de surveiller le ciblage amélioré des cancers et la distribution des thérapeutiques nanostructurées. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est hautement reproductible, efficace et nettement plus facile à mettre en œuvre par rapport à la génie génétique.

Les procédures seront démontrées par Michelle Nguyen et Ivan Ruiz, assistants de recherche de notre laboratoire.

Commencez ce protocole par la production et la purification de nanoparticules du virus de l'hépatite E, comme décrit dans le protocole écrit.

Diluez les échantillons de nanoparticules de HEV entre 0,5 et deux milligrammes par millilitre avec du MES 10 millimolaire, pH 6,2, pour une imagerie en microscopie électronique en transmission (TEM). Ionisez les grilles recouvertes de carbone à l’aide d’une décharge lumineuse de 40 milliampères pendant 30 secondes afin d’obtenir une surface de carbone hydrophile. La surface hydrophile du carbone des grilles ne reste stable que 30 minutes après le traitement par décharge lumineuse. Après ionisation, tenez la grille avec des pinces et ajoutez deux microlitres de l’échantillon de nanoparticules de HEV sur la grille.

Après 15 à 30 secondes, essuyez la grille avec du papier filtre. Ensuite, lavez immédiatement la grille avec de l'eau doublement distillée et essuyez à nouveau avec du papier filtre. Ajoutez immédiatement deux microlitres d'acétate d'urayle à deux pour cent sur la grille. Après 15 secondes, essuyez la grille avec du papier filtre. Sèchez les grilles d'échantillons en les plaçant dans une armoire électronique déshumidifiée pendant toute la nuit.

En fonction de l'échantillon, la microscopie électronique cryogénique ou cryo-ME peut être nécessaire pour la visualisation et la caractérisation de la structure. Transférez la grille dans un MET et observez avec un grossissement compris entre 10 et 80 000. Les nanoparticules du VHE apparaissent en MET comme des protéines icosaédriques vides d'environ 27 nanomètres de diamètre, en raison de l'absence d'ARN viral.

Pour réaliser la conjugaison en une étape des nanoparticules de HEV et de la biotine liée au maléimide, appliquez d'abord les nanoparticules de HEV sur des unités de dialyse miniatures. Dialysez les nanoparticules contre du PBS 0,01 molaire à pH 7,4 pendant une heure à température ambiante, conformément au protocole du fabricant. Après la dialyse, transférez les nanoparticules de HEV dans des tubes de 1,5 millilitre et mesurez la concentration en protéines à 280 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre. Mélangez les nanoparticules à une concentration de un milligramme par millilitre avec une quantité égale de biotine-maléimide à 100 micromolaire et de PBS 0,01 molaire à pH 7,4 afin d'obtenir un rapport molaire de un à cinq. Après une réaction effectuée toute la nuit à quatre degrés Celsius, éliminez la biotine maléimide non liée à l'aide d'une procédure de colonne de désalinisation par centrifugation, conformément au protocole du fabricant. Analysez les échantillons par une électrophorèse SDS-PAGE standard en conditions réduisantes.

En suivant les procédures standard, préparez un immunotransfert chimiluminescent en utilisant une streptavidine liée à la peroxydase et captez le signal chimiluminescent par film radiographique.

Pour réaliser la conjugaison en deux étapes du ligand spécifique des cellules cancéreuses du sein, LXY30, aux cystéines exposées à la surface des nanoparticules de virus de l'hépatite E (HEV), appliquez d'abord les nanoparticules sur des unités de minidialyse et dialysez contre un tampon PBS 0,01 molaire à pH 7,4 pendant une heure à température ambiante. Ensuite, transférez les nanoparticules HEV dans des tubes de 1,5 millilitre et mesurez la concentration en protéines à 280 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre. Puis, mélangez 650 micromolaire de maleimide-azide et 650 micromolaire d’alkyne-LXY30 avec 200 micromolaire de sulfate de cuivre et un millimolaire d’acide ascorbique. Ce mélange forme le LXY30 lié au maleimide à une concentration de 650 micromolaire. Incubez le mélange à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, mélangez les nanoparticules HEV à une concentration d’un milligramme par millilitre avec environ 10 % en volume de LXY30 lié au maleimide, afin d’obtenir un rapport molaire de un à trois. Laissez réagir toute la nuit à quatre degrés Celsius. En raison de la concentration relativement élevée de LXY30-maleimide, les concentrations finales des réactifs, tels que le sulfate de cuivre, sont réduites d’environ dix fois après le mélange. Pour éviter d’endommager les nanoparticules du virus de l’hépatite E, une autre option consiste à utiliser la méthode de conjugaison sans cuivre.

Éliminer le maleimide LXY30 non lié à l’aide d’une colonne de désalinisation par centrifugation, conformément au protocole du fabricant. Conserver les nanoparticules de VHB liées à LXY30 à quatre degrés Celsius. Pour réaliser la conjuguaison en une étape des nanoparticules de VHB LXY30 et de la marque fluorescente Cy5,5, mélanger d’abord les nanoparticules liées à LXY30 à une concentration d’un milligramme par millilitre avec un volume égal de marque fluorescente Cy5,5 afin d’obtenir un rapport molaire de un à cinq. Après avoir laissé réagir le mélange toute la nuit à quatre degrés Celsius, éliminer le Cy5,5 NHS non lié par une procédure de désalinisation sur colonne centrifuge, conformément au protocole du fabricant. Conserver les nanoparticules de VHB liées à LXY30 et Cy5,5 à quatre degrés Celsius.

Deux méthodes ont été tentées pour la fonctionnalisation par LXY30 de nanoparticules HEV afin de cibler les cellules tumorales. Lorsque les nanoparticules HEV 573C ont été d'abord liées à de l'azide de maléimide, suivie d'une réaction de chimie click avec l'alkyne LXY30, les nanoparticules HEV 573C semblaient se désassembler lors de l'observation en microscopie électronique en transmission (TEM). En revanche, une réaction initiale de chimie click entre l'alkyne LXY30 et l'azide de maléimide, formant un LXY30 lié au maléimide, suivie d'une conjugaison aux nanoparticules HEV modifiées, n'a pas affecté leur structure, et les nanoparticules HEV 573C sont restées intactes. Les nanoparticules HEV liées au LXY30 et au Cy5.5 ont été appliquées à des cellules cancéreuses du sein en culture et observées par microscopie confocale. Les images de fluorescence proche infrarouge obtenues par microscopie confocale indiquent que les nanoparticules HEV liées au LXY30 et au Cy5.5 présentaient une affinité de liaison plus élevée et une internalisation accrue dans les cellules cancéreuses du sein MDA MB-231, comparativement aux nanoparticules HEV liées uniquement au Cy5.5.

Les implications de cette technique s'étendent à l'analyse de molécules thérapeutiques et de ciblage multimodal qui permettent un ciblage précis et un diagnostic des tumeurs sans endommager les cellules normales. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le ciblage des cancers et des tumeurs grâce à la modulation chimique de surface, elle peut être appliquée au diagnostic précoce du cancer, au dépistage et au traitement guidé par imagerie.