Rhéométrie force-pince pour caractériser les Hydrogels à base de protéines

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle utilise un PID, qui est un système de dérivée intégrale proportionnelle pour appliquer des protocoles de force contrôlée aux échantillons d’hydrogel de protéines, et qu’elle utilise un petit volume d’échantillon. Les protocoles de la pince de force permettent une interprétation simple des données, tandis que de faibles volumes sont essentiels lorsque l’on travaille avec des protéines difficiles à produire qui ne sont disponibles qu’en petites quantités. Les implications de cette technique s’étendent au développement et à la caractérisation de nouveaux matériaux biométriques à élasticité durable, en utilisant des caractéristiques de transition de repliement et de repliement des protéines.

Cette méthode peut répondre à des questions de mécanique des tissus et des biomatériaux en permettant de mesurer des milliards de molécules de protéines en une seule fois et de simuler des environnements surpeuplés spécifiques aux tissus biologiques. Commencer cette procédure par la préparation des solutions réactives comme décrit dans le protocole texte. Pour synthétiser l’hydrogel à base de protéines, fixez d’abord une aiguille de calibre 23 sur une seringue d’un millilitre avec un piston pressé.

Ensuite, coupez un tube de polytétrafluoroéthylène, ou PTFE, de 10 centimètres à l’aide d’une lame de rasoir. Fixez l’aiguille et la seringue à une extrémité du tube en PTFE. Insérez la deuxième extrémité du tube dans une solution de silane et remplissez le tube en rétractant le piston de la seringue.

Laissez le tube pendant environ 30 minutes. Ensuite, retirez la solution de silane et séchez le tube avec de l’air comprimé. Maintenant, mélangez la solution protéique avec de l’APS et du chlorure de tris(bipyridine)ruthénium(II) dans un tube de 1,5 millilitre en utilisant un rapport de volume constant.

Vortex la solution photoactive jusqu’à ce qu’elle soit complètement mélangée. Ensuite, centrifugez le mélange à vitesse maximale pour éliminer les bulles de la solution. Des bulles peuvent se former lors du chargement du mélange photoactif d’hydrogel dans le tube en téflon, ce qui endommage l’échantillon.

Pour éviter la formation de bulles, maintenez l’extrémité du tube en téflon dans le mélange de solution pendant le processus de chargement et rétractez lentement le piston de la seringue. Insérez l’extrémité ouverte du tube en PTFE traité dans le mélange photoactif et aspirez la solution dans le tube en rétractant le piston de la seringue. Maintenant, placez le tube chargé à environ 10 centimètres d’une lampe au mercure de 100 watts pour éviter de le chauffer et maintenez-le là jusqu’à 30 minutes à température ambiante.

Retirez le tube de l’aiguille et coupez les bords du tube près des extrémités de l’hydrogel avec une lame de rasoir. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 24 émoussée pour extruder l’hydrogel dans la solution Tris. Inspectez visuellement les gels pour détecter tout défaut qui pourrait se former pendant l’extrusion ou en raison de bulles et jetez tous les gels défectueux.

Démarrez le programme de contrôle de l’instrument et allumez le moteur de la bobine mobile. Ensuite, réglez la position de la bobine sur une valeur vers la fin de la plage. Déplacez les crochets dans la direction Z et alignez-les au niveau du coude dans la direction X.

Ensuite, enregistrez les valeurs des vis du micromètre dans la direction X. Maintenant, faites un double nœud lâche à l’extrémité du brin de suture, de sorte que le diamètre de la boucle soit d’environ quatre millimètres. Ensuite, coupez la boucle du brin.

Répétez l’opération pour former une deuxième boucle. Ensuite, placez les deux boucles sur le crochet relié au capteur de force. Remplissez la chambre d’expérimentation avec un tampon Tris et transférez l’échantillon d’hydrogel dans la chambre remplie à l’aide d’une pince à épiler médicale.

Placez les crochets de la bobine mobile et du capteur de force près de la surface de la solution et alignez les crochets dans toutes les directions avec les manipulateurs de positionnement XYZ. À l’aide d’une pince à épiler médicale, accrochez les deux côtés de l’échantillon d’hydrogel de protéines sur les crochets reliés à la bobine mobile et au capteur de force. Une erreur typique est un serrage excessif des boucles de suture autour des échantillons d’hydrogel pendant le processus de fixation.

Cela peut conduire à la formation d’une encoche et à la coupe de l’échantillon d’hydrogel. Serrez soigneusement une boucle de suture autour de l’échantillon d’hydrogel sur le crochet de la bobine mobile en tenant les deux extrémités de la boucle de suture avec une pince à épiler médicale et en les tirant simultanément. Répétez cette étape pour la boucle connectée au capteur de force.

Serrez les boucles de suture sur les coudes de chaque crochet pour éviter tout glissement. Utilisez ces coudes comme points de référence pour trouver la séparation zéro entre les crochets. Coupez les longueurs excessives des sutures à l’aide de ciseaux médicaux.

Déplacez l’hydrogel attaché à l’aide de manipulateurs Z le long de l’axe Z vers la chambre expérimentale pour immerger l’hydrogel dans la solution expérimentale. Alignez l’échantillon d’hydrogel dans YZ à l’aide des manipulateurs de manière à ce que le gel ne soit soumis à aucune contrainte. Mettez le capteur de force à zéro et séparez les deux crochets à l’aide des étapes du micromètre X jusqu’à ce que le gel commence à ressentir une force.

Une fois que cela se produit, tournez légèrement la vis du micromètre dans la direction X. Enregistrez la position des deux manipulateurs pour le moteur de la bobine mobile et le capteur. Ensuite, utilisez la différence entre ces valeurs et celles précédemment mesurées pour calculer la séparation exacte entre les crochets d’attache au début de l’expérience.

Pour effectuer un cycle de rampe de force en augmentant la force au taux de charge souhaité, entrez les valeurs de force de départ et de fin, ainsi que la durée du protocole, qui apparaît sous la forme d’un V inversé, suivi d’une force faible constante pendant environ 200 secondes pour permettre aux domaines protéiques de se replier avant le cycle suivant. Effectuez un protocole à force constante en appliquant une force faible pendant 30 secondes. Ensuite, augmentez la force à une force constante pendant une durée définie, puis maintenez la force à la même valeur faible pendant plus de 300 secondes pour permettre aux domaines protéiques de se replier et à l’élasticité du gel de récupérer.

Enfin, effectuez l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte. Chaque mesure commence par une courbe de relâchement. En installant deux lignes, la force nulle sur le capteur et la longueur réelle du gel sont déterminées.

La longueur réelle du gel est calculée à partir de l’intersection des ajustements et de la position des vis micrométriques. Le système de rhéométrie à pince de force peut appliquer deux types de protocoles différents. En mode rampe de force, l’échantillon d’hydrogel subit un protocole de changement de force avec le temps qui ressemble à un mode de force constante V.In inversé, la contrainte appliquée change selon un modèle en forme d’étape.

Pendant les mesures, le système PID ajuste l’extension de l’hydrogel en modifiant la position de la bobine pour suivre le point de consigne prédéfini du protocole de force. La déformation est ensuite calculée en divisant l’extension mesurée par la longueur réelle du gel. La contrainte est déterminée en divisant la force appliquée à la section transversale de l’échantillon d’hydrogel.

Les traces de rampe de force sont mieux représentées en fonction de la contrainte en fonction de la déformation. Le module de Young peut être calculé à partir de la mesure de la pente pendant la phase de chargement. L’hystérésis donne la dissipation d’énergie provenant du dépliage et du repliement de la protéine.

Les traces à force constante sont mieux représentées en fonction du temps. Le changement de déformation peut être utilisé pour mesurer les taux de dépliage et de repliement en ajustant une double exponentielle. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de sécher le silane du tube avant d’ajouter la protéine, de centrifuger le mélange de protéines pour éliminer les bulles, de vérifier les bulles après avoir injecté le mélange de protéines à l’intérieur du tube et de jeter tous les hydrogels endommagés mécaniquement après l’extrusion du tube.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal au début à fixer les gels aux crochets à l’aide des sutures chirurgicales sans endommager l’échantillon d’hydrogel. L’extrusion du gel du tube peut également endommager l’hydrogel. Cette méthode permet d’appliquer des protocoles à force constante sur des échantillons d’hydrogel de faible volume.

Ces expériences permettent de découpler les comportements élastique et viscoélastique et d’étudier la mécanique du dépliage et du repliement des protéines dans une approche globale. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des sciences des matériaux d’explorer de nouveaux biomatériaux mous tels que les hydrogels à base de polyprotéines modifiées qui ont un excellent potentiel pour servir d’échafaudages d’ingénierie tissulaire, de systèmes d’administration de médicaments et d’encre biologique pour l’impression 3D. Non seulement cette méthode donne un aperçu de la mécanique des hydrogels à base de protéines, mais elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la mesure de la réponse isométrique des fibres musculaires ou de l’élasticité de tissus tels que la peau.