Machine Learning et sans étiquette d’Identification des sous-types de lymphocytes à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle Phase Quantitative
19 novembre 2018
Les auteurs décrivent un protocole d’identification des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et un algorithme d’apprentissage machine exempte d’étiquette. Mesures de l’indice de réfraction 3D tomographies des lymphocytes présentent 3D informations morphologiques et biochimiques des cellules individuelles, qui sont ensuite analysées grâce à un algorithme d’apprentissage automatique pour l’identification des types de cellules.
Cette méthode offre une alternative à l’étiquetage conventionnel de fluorescence et à la procédure d’analyse de cytométrie de flux, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et encourent le risque de modifier la fonction cellulaire des échantillons. Le principal avantage de cette technique est la tomographie à indice réfractif tridimensionnel et l’apprentissage automatique sont des méthodes quantitatives et sans étiquette qui permettent une identification rapide et précise des lymphocytes. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des cancers du sang et des maladies auto-immunes car l’identification des lymphocytes peut être cruciale pour le diagnostic de la maladie et l’application appropriée de traitement.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des populations de lymphocytes, elle peut également être appliquée à l’analyse d’autres cellules individuelles d’intérêt, y compris les bactéries. La démonstration visuelle de la technologie d’imagerie quantitative de phase 3D est essentielle, car elle facilite une instruction claire sur la façon d’exécuter la technique et peut fournir un aperçu de ses applications. Commencez par recueillir chaque sous-ensemble de lymphocytes par tri cellulaire activé par fluorescence.
Pour une imagerie optimale, diluer chaque échantillon cellulaire à une concentration de 180 cellules par microlitre de milieu RPMI, et injecter lentement 120 microlitres du premier échantillon dilué dans une chambre d’imagerie. Après avoir confirmé l’absence de bulles dans la chambre, placez une goutte d’eau distillée sur la lentille objective d’un microscope de phase quantitative 3D et placez la chambre d’imagerie sur l’étape de traduction du microscope. Ajustez l’étape de sorte que l’échantillon s’aligne avec la lentille objective, et cliquez sur la mise au point et la surface dans l’onglet d’étalonnage de la perspective microscope du logiciel d’imagerie pour ajuster les positions axiaales des lentilles objectif et condenseur, respectivement.
Cliquez sur le mode Automatique pour aligner les lentilles objectif et condenseur. Pour optimiser l’alignement, ouvrez le mode numérisation et ajustez manuellement les lentilles pour aligner le modèle numérique de périphérique micromirror au centre. Ensuite, revenez en mode Normal et ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule dans le champ de vision.
Ajustez la position axial de la lentille objective pour trouver le plan focal jusqu’à ce que la limite de l’échantillon visualisée dans l’écran soit presque invisible. Il est important d’ajuster parfaitement l’orientation de la cellule pour générer une tomographie 3DRI optimale. Si l’image n’est pas prise correctement, la reconstruction 3D sera altérée, ce qui entraîne une tomogramme bruyante.
Ajustez l’étape de traduction pour trouver un emplacement sans cellule et cliquez sur Calibrate pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec différents angles d’éclairage. Ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule au centre du champ de vision. Et sous l’onglet Acquisition, nommez l’échantillon en cours d’image.
Cliquez sur instantané 3D pour mesurer les hologrammes de la cellule en utilisant les mêmes angles d’éclairage que pour les hologrammes 2D juste mesurés. Lorsque les données acquises apparaissent dans le panneau de gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Processus pour reconstruire un tomogramme d’index réfractif 3D à partir des hologrammes 2D à l’aide de l’algorithme de tomographie de défraction mis en œuvre dans le logiciel d’imagerie. Après l’imagerie, dans le panneau gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données.
Cliquez sur le centre de la cellule pour le repositionner et cliquez sur RI Tomogram sur le panneau Data Manager. Sur l’onglet Preset cliquez sur Charge et double clic lymphocyte. xml, qui est une fonction de transfert prédéfinie fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser la tomographie selon les distributions 3DRI.
Faites défiler la souris pour zoomer et faites glisser la cellule pour la faire pivoter dans n’importe quelle direction. Pour l’extraction quantitative des caractéristiques morphologiques et biochimiques, placez toutes les données tomographiques dans un seul dossier et divisez les types de cellules dans les sous-composants individuels dans le dossier principal. Ensuite, ouvrez le fichier d’extraction de fonctionnalités supplémentaires dans le logiciel d’imagerie approprié et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier de tomographie à partir duquel les données doivent être extraites.
Modifier la ligne 15 pour désigner le dossier auquel les données de fonctionnalité extraites doivent être enregistrées et exécuter le code. Pour chaque tomogramme de l’ensemble de données, le code calculera la surface, le volume cellulaire, la sphérité, la densité des protéines et la masse sèche par seuil d’index réfractif. Pour l’apprentissage supervisé et l’identification, utilisez l’algorithme simple de fractionnement aléatoire dans MATLAB pour diviser aléatoirement les données de fonctionnalités extraites en dossiers distincts de formation et d’ensemble de tests.
Ouvrez le fichier de formation supplémentaire et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier d’ensemble de formation, la ligne 16 pour désigner le dossier pour enregistrer le classificateur formé et la ligne 17 pour définir un nom de fichier pour le classificateur. Ensuite, exécutez le code. En utilisant les fonctionnalités sélectionnées de l’ensemble de formation, le code formera un classificateur avec l’algorithme voisin le plus proche K et enregistrera le classificateur dans le dossier désigné.
Ensuite, ouvrez le fichier de test supplémentaire trois, et modifiez les lignes 14 à 15 pour désigner le classificateur formé à tester et la ligne 17 pour désigner l’ensemble de test formé. Ensuite, exécutez le code. Le classificateur identifiera les types de cellules des lymphocytes individuels dans l’ensemble d’essai.
Ici, des tomogrammes d’index réfractifs représentatifs rendus en 3D des lymphocytes B, des lymphocytes T positifs CD4 et des lymphocytes T positifs CD8 avec différents schémas de couleurs, attribués en fonction des valeurs d’index réfractives attribuées via le logiciel d’imagerie sont affichés. À partir des valeurs de l’indice réfractaire, les caractéristiques quantitatives morphologiques et biochimiques peuvent être calculées. Dans cette expérience, l’exactitude de la classification des lymphocytes T et B était de 93,15 % et de 89,81 % respectivement pour les cas de formation et de test.
Les lymphocytes T positifs CD4 et CD8 ont été classés statistiquement, et l’exactitude était de 87,41 % et 84,38 % respectivement pour les ensembles de formation et de test. Enfin, la précision du classificateur de type cellulaire multiclasse était de 80,65 % et de 75,93 % respectivement pour les étapes de formation et de test. La qualité et le nombre d’images sont essentiels au succès de cette technique.
Plus la qualité de l’image est bonne et plus le volume de données est élevé, meilleure est la précision de l’identification. L’apprentissage profond peut être utilisé pour analyser plus complètement les données complexes des tomogrammes, améliorant fortement les performances d’identification. De plus, la fluorescence et l’imagerie quantitative de phase 3D peuvent être utilisées pour étudier la trajectoire des rôles physiologiques des lymphocytes identifiés.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et de la biomédecine pour explorer des maladies spécifiques d’intérêt dans différents organismes. En effet, les immunologistes en particulier, peuvent bénéficier de l’utilisation de cette nouvelle technologie pour identifier la population d’intérêt.
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Aperçu
Cet article présente une méthode sans marquage pour l'identification des sous-types de lymphocytes à l'aide de l'imagerie quantitative en phase combinée à l'apprentissage automatique. Cette technique offre une alternative rapide et précise aux méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence et de cytométrie en flux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Les méthodes conventionnelles d'identification des lymphocytes peuvent être longues et coûteuses.
- Le marquage par fluorescence peut altérer la fonction cellulaire.
- La tomographie tridimensionnelle de l'indice de réfraction fournit des informations détaillées sur la morphologie et la biochimie.
- L'apprentissage automatique améliore la précision de l'identification des types cellulaires.
Objectif de l'étude
- Développer une technique sans marquage pour l'identification des sous-types de lymphocytes.
- Améliorer la rapidité et la précision de l'analyse des lymphocytes.
- Explorer les applications en thérapie des cancers sanguins et des maladies auto-immunes.
Méthodes utilisées
- Imagerie de phase quantitative pour la tomographie tridimensionnelle de l'indice de réfraction.
- Algorithmes d'apprentissage automatique pour l'identification des types cellulaires.
- Tri cellulaire activé par fluorescence pour la collecte de sous-populations de lymphocytes.
- Démonstrations visuelles pour faciliter la compréhension de la technique.
Résultats principaux
- La méthode permet une identification rapide et précise des sous-types de lymphocytes.
- Elle fournit des informations sur les populations de lymphocytes et d'autres cellules uniques.
- La technique est applicable à divers domaines au-delà de l'immunologie.
- Des démonstrations visuelles améliorent la qualité pédagogique du protocole.
Conclusions
- Cette méthode sans étiquetage représente une avancée significative dans l'analyse des lymphocytes.
- Elle présente des implications potentielles pour le diagnostic et le traitement des cancers sanguins et des maladies auto-immunes.
- L'approche peut être adaptée à d'autres types cellulaires, élargissant ainsi son champ d'application.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'identification sans marquage des sous-types de lymphocytes répond à un goulot d'étranglement majeur dans la recherche en immunologie et en immuno-oncologie en éliminant le besoin d'un marquage fluorescent, qui peut perturber la fonction cellulaire et introduire des variabilités. Cette méthode permet un profilage phénotypique rapide, quantitatif et reproductible des cellules immunitaires à une résolution unicellulaire, soutenant ainsi la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. L'intégration de la tomographie tridimensionnelle de l'indice de réfraction avec l'apprentissage automatique offre une plateforme évolutible pour la surveillance immunitaire dans les modèles précliniques de cancers sanguins et de maladies auto-immunes.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des sous-populations de lymphocytes sans étiquetage exogène, préservant ainsi le phénotype et la fonction natifs pour des tests d'hypothèses ciblés précis.
- Valeur opérationnelle : Réduit la complexité et la variabilité des tests liées à la coloration par anticorps, améliorant la reproductibilité entre laboratoires et au fil du temps.
- Valeur prédictive : Facilite la validation fonctionnelle de cibles immunomodulatrices en associant caractéristiques morphologiques et biochimiques à l'identité cellulaire dans un contexte sans étiquette.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des caractéristiques morphologiques et biochimiques quantitatives (par exemple, volume, sphéricité, densité protéique) à partir de tomogrammes d'indice de réfraction 3D, permettant un phénotypage multiparamétrique des cellules immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à un contraste optique intrinsèque, éliminant les effets de lot liés au marquage par anticorps et aux variations instrumentales.
- Évolutivité : Compatible avec les flux de travail d'imagerie à haut contenu et les pipelines d'apprentissage automatique pour un profilage immunitaire à grande échelle dans le cadre de campagnes de criblage thérapeutique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet le suivi longitudinal de sous-types de lymphocytes dans des modèles précliniques de maladies sans perturber la physiologie cellulaire, soutenant des lectures d'efficacité alignées sur des biomarqueurs.
- Réduction des risques mécanistiques : Fournit une validation sans marquage des réponses des cellules immunitaires à des candidats thérapeutiques, réduisant les faux positifs dus aux artefacts de marquage.
- Précision prédictive : Atteint une précision supérieure à 80 % dans la classification multiclasse des lymphocytes, permettant une surveillance immunitaire fiable dans les études translationnelles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'engagement de la cible immunitaire à la validation fonctionnelle, permettant une surveillance immunitaire sans marquage entre l'identification des hits et les étapes d'optimisation du composé précurseur.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les mécanismes immunomodulateurs en fournissant un phénotypage quantitatif et sans marquage des cellules immunitaires.
- Écrans : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles (par exemple, masse sèche, surface) permettant de comparer les effets de composés sur la morphologie et la densité des lymphocytes.
- Analytique : Génère des jeux de données structurés compatibles avec des classificateurs d'apprentissage automatique, permettant une identification objective des types cellulaires fondée sur les données.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en permettant une surveillance non invasive de la dynamique des cellules immunitaires dans des modèles de maladie.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reconfigurable de profilage immunitaire sans marquage, applicable à divers domaines thérapeutiques et systèmes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les ambiguïtés mécanistiques liées aux artefacts induits par le marquage.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et le débit grâce à un imagerie normalisée et sans marquage ainsi qu’à une extraction automatisée des caractéristiques.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d’aller/arrêt en fournissant des données fiables sur la réponse immunitaire, réduisant ainsi le risque d’échec en phase avancée des programmes en immuno-oncologie et dans les maladies auto-immunes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats immunomodulateurs fondée sur des phénotypes cellulaires immunitaires quantitatifs et sans marquage.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie quantitative de phase, en reconstruction de tomogrammes 3D et en flux de travail d'apprentissage automatique pour l'extraction et la classification de caractéristiques.
- Dépend de l'accès à un microscope 3D d'imagerie quantitative de phase et à un logiciel capable de réaliser une tomographie d'indice de réfraction et de visualiser les tomogrammes.
- Exige des protocoles standardisés de préparation cellulaire et d'acquisition d'images afin d'assurer la qualité des tomogrammes et leur reproductibilité entre utilisateurs et sites.
- Implique l'adaptation des pipelines d'extraction de caractéristiques à différents sous-ensembles de lymphocytes ou systèmes modèles selon les distributions d'indice de réfraction.
- Est limité par la nécessité de tomogrammes 3D de haute qualité de l'indice de réfraction ; un mauvais réglage du foyer ou une préparation d'échantillon sous-optimale peut altérer la reconstruction et réduire la précision de la classification.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
3D Quantitative Phase Imaging
4:34
Quantitative Morphological and Biochemical Feature Extraction and Supervised Learning and Identification
6:42
Results: Representative Label-Free Lymphocyte Subtype 3D Phase Imaging Identification
7:56
Conclusion
