Séparation de bactéries par Capsule montant à l’aide d’un Gradient de densité discontinu
7 janvier 2019
Nous montrons l’utilisation des gradients de densité discontinu pour séparer les populations bactériennes basées sur la production de la capsule. Cette méthode est utilisée pour comparer capsule montant entre les cultures, isoler des mutants ayant un phénotype capsule spécifique ou d’identifier des régulateurs de la capsules. Décrite ici est l’optimisation et le déroulement de l’essai.
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de Klebsiella, telles que les gènes utilisés pour réguler la capsule et les virulents associés. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle fournit un moyen de séparer physiquement les souches capsulées et non capsulées, et elle peut également être utilisée pour des comparaisons rapides entre les souches de production de capsules. Bien que cette méthode ait été développée pour étudier la régulation des capsules à Klebsiella, elle peut également être appliquée à différentes espèces bactériennes.
Généralement, les individus qui sont nouveaux à cette méthode auront du mal parce que verser les gradients et l’ajout des cellules aux gradients peut être assez difficile. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car nous montrons les techniques qui sont difficiles à maîtriser, fournissant des suggestions et des conseils pour aider l’utilisateur. Pour commencer, choisissez une seule colonie à partir d’une plaque de stock avec une boucle stérile, et inoculez 10 millilitres d’un bouillon approprié.
Incubez la culture du jour au lendemain. Ensuite, transférez la culture dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse. Ensuite, jetez le supernatant et suspendez la pastille en deux millilitres de PBS.
Répétez la centrifugation et jetez le supernatant qui en résulte. Puis suspendez la pastille en deux millilitres de PBS. Pour créer les dilutions de gradient de densité, combinez le milieu de gradient de densité avec le PBS.
Puis aliquot 600 microlitres de chaque dilution de gradient en tubes individuels de deux millilitres. Prenez 100 microlitres de cellules avec une pipette de 200 microlitres, et placez la pointe pipette sur le côté du tube juste en dessous du ménisque de l’un des nombreux gradients. Aspirez les cellules bactériennes sur le gradient très lentement, en prenant soin de ne pas mélanger l’interface.
Centrifugeuse les tubes préparés pendant 10 minutes à 8000 g. Après cela, transférez les tubes sur une grille pour visualiser la dilution minimale de gradient nécessaire pour retenir les cellules juste au-dessus de la couche de gradient. Tout d’abord, transférez un millilitre de la dilution de gradient de densité la plus diluée dans un tube à fond rond de cinq millilitres.
À l’aide d’une seringue avec une aiguille de 1,5 pouce, prendre un millilitre du gradient de densité le plus concentré suivant. Placez l’aiguille au fond du tube et injectez le contenu de la seringue très lentement. Il doit y avoir une interface claire à chaque étape du gradient de densité.
Si les couches se mélangent, vous n’atteindrez pas la séparation propre de vos bactéries. Retirez doucement l’aiguille du gradient afin de ne pas perturber l’interface entre les dilutions de gradient. Ensuite, placez le tube dans une grille.
Ajouter soigneusement 600 microlitres des cellules préparées au sommet du gradient dans le tube. Placez ensuite le tube dans un adaptateur de tube, et pesez le tube avec l’adaptateur pour assurer l’équilibre. Après cela, placez l’adaptateur de tube dans un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse à dessus de banc, et centrifuger le tube pendant 30 minutes à 3000 g.
Enfin, après centrifugation, retirez soigneusement le tube, placez-le dans une grille et photographiez les résultats. Dans ce protocole, la centrifugation du gradient de densité a été utilisée pour séparer les souches bactériennes en fonction de la quantité de capsules qu’elles produisent. Bien que les résultats exacts dépendent de l’espèce bactérienne, la plupart des souches migreront vers un seul endroit dans le gradient.
L’application de cette méthode à une bibliothèque mutante bactérienne devrait produire une bande majeure au-dessus du gradient, une bande moins dense à travers la couche supérieure du gradient, et une fraction acapsulaire mineure au fond. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les interfaces de gradient ne doivent pas être mélangées, et le gradient ne doit pas contenir des bulles d’air. Après la procédure, des méthodes de validation telles que l’analyse de l’acide uronique ou la microscopie devraient être effectuées pour examiner les quantités de capsules.
Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation de cette technique pour de nouvelles souches. N’oubliez pas que travailler avec les agents pathogènes du groupe Hazard 2 peut être dangereux. Des précautions telles que l’équipement de protection corrective, le respect des évaluations des risques et l’élimination correcte des cultures doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
Aperçu
Cet article démontre l'utilisation de gradients de densité discontinus pour séparer des populations bactériennes selon la production de capsule. La méthode permet de comparer les quantités de capsule entre des cultures, d'isoler des mutants présentant des phénotypes de capsule spécifiques et d'identifier des régulateurs de capsule.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les agents pathogènes
Contexte
- La production de capsule chez les bactéries est liée à la virulence.
- La compréhension de la régulation de la capsule peut orienter les stratégies thérapeutiques.
- Les gradients de densité discontinus constituent une méthode de séparation physique.
- Cette technique peut être appliquée à diverses espèces bactériennes.
Objectif de l'étude
- Optimiser une méthode permettant de séparer les souches bactériennes capsulées et non capsulées.
- Faciliter des comparaisons rapides de la production de capsule entre différentes souches.
- Fournir une démonstration visuelle de la technique afin d'en améliorer la compréhension.
Méthodes utilisées
- Inoculation de cultures bactériennes et incubation nocturne.
- Centrifugation et re-suspension des culots bactériens dans le PBS.
- Préparation de dilutions en gradient de densité et dépôt soigneux des cellules.
- Centrifugation pour obtenir une séparation selon la production de capsule.
Résultats principaux
- Séparation réussie de souches bactériennes selon les niveaux de production de capsule.
- Identification de bandes distinctes correspondant aux fractions capsulées et acapsulaires.
- Des méthodes de validation telles que les dosages des acides uroniques ont confirmé les quantités de capsule.
- Mise en évidence de l'importance du maintien des interfaces de gradient pour une séparation nette.
Conclusions
- La méthode est efficace pour l'étude de la régulation de la capsule chez Klebsiella et d'autres bactéries.
- Les démonstrations visuelles sont cruciales pour maîtriser la technique.
- Les précautions de sécurité sont essentielles lorsqu'on travaille avec des souches pathogènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'isoler physiquement des sous-populations bactériennes en fonction de l'expression de la capsule, un facteur de virulence clé influant sur l'évasion immunitaire et la résistance thérapeutique. En fournissant un outil de séparation semi-quantitatif, elle soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes de développement d'antimicrobiens et de vaccins. L'approche améliore la confiance prédictive lors de l'évaluation des phénotypes liés à la capsule au sein de bibliothèques de souches ou de collections de mutants.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies de biosynthèse de la capsule en séparant les souches fortement et faiblement productrices pour une analyse génétique ultérieure.
- Valeur opérationnelle : Facilite le criblage phénotypique rapide de bibliothèques de mutants afin d'identifier les régulateurs de la production de capsule.
- Valeur translationnelle : Permet l'isolement de mutants acapsulaires ou hypercapsulaires pour leur utilisation dans la modélisation de la virulence et la sélection d'antigènes.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des populations fractionnées adaptées à des dosages quantitatifs de capsule, tels que la mesure des acides uroniques.
- Valeur opérationnelle : Crée des entrées standardisées et reproductibles pour le criblage à haut débit de composés ou de perturbations génétiques affectant l'expression de la capsule.
- Préparation au dosage : Produit des fractions capsulées purifiées qui améliorent les rapports signal sur bruit dans les dosages fonctionnels ou immunologiques ultérieurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre génotype et phénotype en permettant la corrélation des sites d'insertion de transposons avec les niveaux de capsule dans les protocoles de séquençage.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode évolutive pour générer des souches isogéniques possédant des quantités définies de capsule, destinées à des études de pharmacocinétique ou d'efficacité.
- Continuité translationnelle : Permet une progression adaptée au risque en offrant aux équipes la possibilité d'éliminer les risques associés aux cibles grâce à une modulation de la capsule validée.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, permettant de passer du criblage phénotypique à l'identification de la cible et à la validation préclinique, notamment dans les programmes anti-infectieux où la capsule est un déterminant de la pathogénicité.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant la séparation physique de souches afin de préciser le rôle de la capsule dans l'évasion immunitaire ou la résistance au stress.
- Écrantage : Permet la collecte de fractions prêtes à être analysées pour une comparaison quantitative de la production de capsule entre différentes variantes de souches ou conditions de traitement.
- Analytique : Génère des bandes distinctes et visibles qui servent de lectures semi-quantitatives pour le tri et une validation analytique ultérieure.
- Recherche translationnelle : Relie la modulation de la capsule en phase de découverte à des modèles précliniques en fournissant des souches phénotypiques définies pour des études d'infection ou de challenge.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable de phénotypage de la capsule, applicable à plusieurs cibles bactériennes dans un portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique liée à la virulence associée à la capsule en permettant une corrélation directe entre phénotype et génotype.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation de l'analyse de la capsule par rapport aux mesures effectuées sur des cultures en masse.
- Valeur stratégique : Permet de mieux orienter les décisions de sélection des cibles (aller ou ne pas aller plus loin) en fournissant des données empiriques sur l'efficacité de la modulation de la capsule.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles antimicrobiennes ou vaccinales en se basant sur des phénotypes de capsule validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des cultures bactériennes et la préparation de gradients de densité.
- Dépend de l'accès à un équipement de centrifugation capable d'un contrôle précis de la vitesse et de la température.
- Exige une technique soigneuse afin d'éviter le mélange des couches du gradient ou l'introduction de bulles d'air lors de la mise en place.
- Doit être adapté à chaque espèce bactérienne par l'optimisation des concentrations du gradient et des paramètres de centrifugation.
- S'appuie sur des méthodes de validation post-séparation telles que des tests biochimiques ou la microscopie pour confirmer les niveaux de capsule dans les fractions.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Bacterial Strains of Mutant Libraries
1:40
Preparation of Gradient Dilutions and Mini-gradient Test
2:39
Preparation of Discontinuous Density Gradients
3:39
Adding Prepared Cells to Gradients and Separation by Centrifuge
4:30
Results: Density Gradient Centrifugation Used to Separate Bacterial Strains Based on Capsule Production
5:10
Conclusion
