Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative
26 janvier 2019
ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.
L’essai traditionnel de détection d’ARN à double brin n’est habituellement pas assez sensible pour détecter l’ARN à double brin formé dans l’infection négative-sens de virus d’ARN. Par conséquent, l’interaction entre l’ARN à double brin et les récepteurs de reconnaissance du modèle hôte est restée largement insaisissable pour ces virus. En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de visualiser et de caractériser l’interaction entre la protéine nucléaire virale, l’ARN à double brin et l’hôte d’un PRR à un niveau d’une seule cellule pour le virus de l’ARN à sens négatif. Il s’agit d’un test multiplexe qui permet la coloration simultanée de l’ARN double brin et deux cibles virales ou de protéines hôtes dans les cellules individuelles. Contrairement à l’analyse ARN-FISH, cette technique est indépendante de la séquence arn et généralement compatible avec la détection d’anticorps des cibles protéiques. Commencez 24 heures avant l’infection en ensemencement de 200 000 cellules A549 épithéliales pulmonaires humaines sur des couvercles en verre enduits de Poly-D-Lysine glissés dans des plaques de 12 puits et les cultivant à 37
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Aperçu
Cette étude examine la reconnaissance de l'ARN double brin (dsRNA) produit lors de la réplication des virus à ARN par les récepteurs de reconnaissance de motifs (PRRs), qui induit une réponse immunitaire innée. L'attention est portée sur les virus à ARN de sens négatif, pour lesquels l'interaction entre le dsRNA à faible concentration et les PRRs n'est pas bien comprise. Une méthode de microscopie confocale a été mise au point pour visualiser le dsRNA des arénavirus et les PRRs au niveau de cellules individuelles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Virologie
Contexte
- L'ARN double brin est un sous-produit de la réplication des virus à ARN.
- Les récepteurs de reconnaissance de motifs jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée.
- L'interaction entre l'ARN double brin et les RRM dans les virus à ARN de sens négatif est mal comprise.
- La visualisation de l'ARN double brin et des RRM peut améliorer la compréhension de l'évasion immunitaire virale.
Objectif de l'étude
- Élucider l'interaction entre l'ARN double brin et les RPR dans les virus à ARN de sens négatif.
- Développer une méthode permettant de visualiser ces interactions au niveau de cellules individuelles.
- Contribuer à la compréhension de la réponse immunitaire innée aux virus à ARN.
Méthodes utilisées
- Microscopie confocale pour la visualisation de l'ARNsd et des RPR.
- Tests cellulaires pour évaluer la réponse immunitaire.
- Analyse des niveaux d'ARNsd durant la réplication virale.
- Études comparatives avec différents virus à ARN.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de l'ARNsd et des RPR chez des cellules individuelles.
- Identification d'interactions spécifiques entre l'ARNsd et les RPR.
- Apports de connaissances sur les mécanismes de réponse immunitaire déclenchés par l'ARNsd.
- Précision du rôle de l'ARNsd dans la pathogenèse virale.
Conclusions
- La méthode de microscopie confocale développée est efficace pour l'étude des interactions entre l'ARNdb et les RPR.
- La compréhension de ces interactions pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les virus à ARN.
- Cette recherche contribue au domaine plus vaste de l'immunologie virale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La visualisation de l'ARN double brin (dsARN) présent en faible abondance lors d'une infection par un virus à ARN de sens négatif comble une lacune critique dans la compréhension de l'activation de l'immunité innée et de l'évasion immunitaire virale. Cette capacité soutient la validation des cibles et la réduction des incertitudes mécanistiques dans la découverte d'antiviraux, en permettant l'observation directe de l'interaction entre les récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR) et les intermédiaires de réplication viraux. La méthode renforce la confiance prédictive dans le choix précoce des cibles pour les arénavirus et les pathogènes apparentés, orientant ainsi la priorisation des portefeuilles dans les programmes portant sur des pathogènes nécessitant une haute sécurité.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant les interactions ARNdb-PRR à la résolution monocellulaire dans des modèles viraux pathogènes.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode de détection sensible et indépendante de la séquence, compatible avec la coloration multiplexée de protéines pour la clarification des voies.
- Valeur prédictive : Facilite la dé-risquisation biologique des cibles PRR en confirmant l'engagement du ligand dans des contextes d'infection pertinents.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des lectures quantitatives et spatialement résolues de la colocalisation de l’ARNdb et des RPR pour la standardisation des tests.
- Pertinence pour le criblage : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en établissant des métriques de base d’activation immunitaire.
- Utilité de la plateforme : Compatible avec la détection par anticorps, permettant une réutilisation pour différents virus cibles et protéines de l’hôte dans les protocoles d’imagerie.
Recherche Translationnelle et Préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les observations issues de la découverte à la validation préclinique en cartographiant la distribution de l'ARNdb et le recrutement des RPR dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Compréhension mécanistique : Précise la dynamique spatiale et temporelle de la signalisation immunitaire innée, orientant le choix des biomarqueurs pour la modulation de la voie.
- Avancement ajusté au risque : Permet des décisions fondées sur des données (aller ou ne pas aller) basées sur la confirmation visuelle de l'engagement de la cible dans des modèles à haute pathogénicité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification de composés précurseurs, jusqu'à la validation préclinique, en particulier pour les antiviraux immunomodulateurs ciblant les voies PRR.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les mécanismes d'agonistes/antagonistes des RPR en visualisant l'ARNdb comme ligand endogène dans les cellules infectées.
- Écrans : Fournit des résultats d'imagerie quantitatifs et reproductibles permettant de comparer les effets de composés sur les interactions ARNdb-RPR.
- Analytique : Offre des signaux fluorescents multiplexés (ARNdb, protéine virale, RPR) pour une analyse riche des états d'activation immunitaire.
- Recherche translationnelle : Relie les observations in vitro à la continuité préclinique en confirmant l'activation des RPR dans des modèles primaires ou dérivés de cellules souches d'épithélium pulmonaire.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'imagerie standardisée applicable à de multiples virus à ARN simple brin négatif et à d'autres cibles de l'hôte que les arénavirus.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des interactions entre les récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR) et leurs ligands.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité des tests grâce à des protocoles normalisés de microscopie confocale et à une détection sensible des ARN double brin.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions « aller/stop » en fournissant une preuve visuelle directe de la modulation de la voie, réduisant ainsi l'abandon en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats immunomodulateurs fondée sur un engagement confirmé de la cible dans des contextes de virus pathogènes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en microscopie confocale, en coloration par immunofluorescence et en techniques de virologie adaptées au niveau de biosécurité approprié.
- Dépend de l'accès à des anticorps anti-ARNsd à haute sensibilité (par exemple, clone 9D5) et à une infrastructure d'imagerie de fluorescence compatible.
- Implique une standardisation entre laboratoires pour assurer une quantification fiable du signal d'ARNsd et une analyse cohérente des colocalisations.
- Doit tenir compte de la variabilité des modèles cellulaires (par exemple, A549 par rapport à l'épithélium respiratoire primaire) en ce qui concerne la production d'ARNsd et les niveaux d'expression des PRR.
- Les limites pratiques comprennent la possibilité de réactivité croisée des anticorps et la nécessité d'optimiser les protocoles dans des environnements de haute confinement (NBL-3/NBL-4).
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
