Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

Le diagnostic de la maladie de Parkinson repose toujours sur des signes cliniques de participation motrice qui apparaissent plus tard au cours de la maladie, lorsque la plupart des neurones du nigra substantia sont déjà perdus. Ce protocole permet d’utiliser l’analyse des nerfs cutanés par biopsie cutanée, qui représente un nouveau biomarqueur potentiel de la maladie, dans le cadre d’essais cliniques. La biopsie cutanée est une procédure facilement évaluable et non invasive qui permet l’analyse du tissu nerveux périphérique qui est sujette à la pathologie.

Alpha synucléine agrégats détection par biopsie de la peau peut être utilisé à des fins diagnostiques, peut-être à des phases précoces, lorsque la guérison potentielle est le plus efficace. Les biopsies de peau de suivi dans le même patient permettent une analyse de temps et de cours spécial de l’agrégat d’alpha synuclein se propageant dans le système nerveux cutané humain. Ceux-ci peuvent faire la lumière sur la pathogénie de la maladie.

Pour commencer cette procédure, préparez une nouvelle solution fixative PLP telle qu’elle est décrite dans le tableau un du protocole texte. Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, submergez-la dans un tube contenant 10 millilitres de la solution fixative. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, dans une hotte de fumée, retirez doucement le fixatif PLP. Dans le même tube, laver la biopsie trois fois pendant cinq minutes chacune, à l’aide de cinq millilitres de la solution de la molaire Sorensen pour chaque lavage. Jetez la solution du Sorensen et ajoutez cinq millilitres de solution cryoprotectrice.

Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, stockez la biopsie à quatre degrés Celsius si la coupe avec un cryotome doit être effectuée dans un délai d’une semaine. Tout d’abord, réglez le cryotome à moins 20 degrés Celsius.

Prenez un cryomold et remplissez-le avec un milieu cryo-enseurgeant. À l’aide d’une pince à épiler, plonger la biopsie dans le milieu cryo-entéré, avec l’axe longitudinal parallèle au fond du cryomold. Snap congeler l’échantillon avec de l’azote liquide, pour obtenir un cube solide de cryo-intégration milieu contenant la biopsie dans la bonne orientation.

Mettez l’échantillon dans le cryostat et attendez 30 minutes pour permettre à la biopsie de s’acclimater. Ensuite, fixez l’échantillon sur le cryostat et coupez-le en sections de 50 micromètres. À l’aide d’une petite brosse, transférer les cryo-sections dans une plaque de 96 puits contenant 200 microlitres de solution antigel dans chaque puits.

Après cela, conserver la plaque à moins 20 degrés Celsius. Pour commencer, remplissez certains des puits d’une assiette fraîche de 96 puits avec 100 microlitres de solution de lavage. Transférez les sections à analyser de la plaque de stockage à celle contenant la solution de lavage.

Laissez les sections dans la solution de lavage pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez chaque section dans un puits vide contenant la même solution de lavage, et répétez le lavage. Ensuite, ajoutez une solution de lavage aux sections et transférez-les dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de solution de blocage.

Incuber à température ambiante pendant au moins 90 minutes, et un maximum de quatre heures. Diluer les anticorps primaires, anti-PGP9.5 et anti-5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps primaires, et incuber toute la nuit à température ambiante.

Le lendemain, lavez les sections dans des puits contenant une solution de lavage comme décrit précédemment. Diluer les anticorps secondaires, chèvre anti-lapin pour détecter PGP9.5, et chèvre anti-souris pour détecter 5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps secondaires.

Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué à des anticorps secondaires, et incuber à température ambiante pendant 90 minutes. Après cela, laver les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de DAPI pendant cinq minutes à température ambiante.

Lavez les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, montez les sections sur une glissière dans la bonne position, en évitant les mauvais déroulements. Ajouter quelques gouttes de milieu de montage à la lame et couvrir la section d’un glissement de couvercle.

Laissez sécher les toboggans pendant la nuit. Le lendemain, rangez les glissières dans une boîte appropriée à quatre degrés Celsius, en vous assurant d’éviter l’exposition à la lumière. À l’aide d’un microscope à fluorescence inversé ou d’un microscope confocal, visualisez les sections.

Acquérir les images par une caméra connectée au microscope. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d’intensité du signal tel que décrit dans le protocole texte. Suivant la méthode décrite, des agrégats alpha synucléine étiquetés avec l’anticorps 5G4 sont détectés dans les fascicles de nerf dermique innervant des structures autonomes des patients de.

La morphologie des dépôts alpha synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs cutatéaux. L’utilisation représentative de ce protocole chez 19 patients atteints de MP et 17 contrôles dans les biopsies cutanées à trois sites anatomiques montre que la 5G4 a une sensibilité de 81% et une spécificité de 86% par rapport aux contrôles sains. La synucléine alpha phosphorylatée a une sensibilité de 56% et une spécificité de 100%5G4 et des dépôts alpha synuclein-positifs phosphorylatés se trouvent principalement autour des glandes sudoripares, mais sont également trouvés dans le pili d’arriéré de muscle, les petits vaisseaux, et le plexus subepidermal et dermique, mais jamais dans les fibres intraepidermales de nerf.

Généralement, dans les glandes sudoripares lumen, il est possible d’observer un signal non spécifique qui pourrait être mal interprété comme 5G4 ou phosphorylated alpha synuclein positivité. Ce type de signal est pointillé, sphérique, et il est probablement dû au matériel autofluorescent intraluminal tel que démontré dans les contrôles techniques sans anticorps primaires et secondaires. La colocalisation avec PGP9.5 qui marque les fibres nerveuses, qui sont morphologiquement filamenteuses et allongées, aide à identifier le signal correct.

Par conséquent, la spécificité du signal 5G4 est fortement augmentée par une double immunostaining avec un marqueur axonal. Une fixation précise de la biopsie est nécessaire pour produire une coloration immunofluorescente de bonne qualité et pour l’interprétation fiable des signaux fluorescents. Si le fixatif n’est pas correctement préparé, ou si une sur-fixation s’est produite, le résultat sera une autofluorescence élevée qui masquera le signal des fibres nerveuses traversant la jonction dermique-épidermique, ou innervate les structures cutanées principales.

L’étape la plus critique de cette procédure est la fixation des tissus. Faites attention au pH de la solution fixative PLP, et le moment de l’incubation, pour éviter l’autofluorescence et un signal spécifique.