Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase
21 décembre 2019
Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l'identification des inhibiteurs de ces interactions.
L’interaction HBX-DDB1 est une étape cruciale pour promouvoir la transcription du VPH à partir de l’AICDNA, de sorte que ce protocole peut devenir un atout clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour la guérison fonctionnelle du VPH. Notre procédure est simple et ne nécessite qu’un court laps de temps pour l’écran. L’interaction que je mélange peut être détectée en temps réel sans nécessiter de lyse cellulaire.
En outre, la qualité de dépistage est satisfaisante avec un score élevé Z prime. L’inhibition de l’interaction HBX-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription du VPH, de l’expression des protéines et de la production de cccDNA. Ce nouveau mécanisme d’action antivirale peut surmonter les insuffisances des thérapies actuelles de HPV.
Les interactions protéine-protéine sont une classe importante de cibles médicamenteuses. L’acide à base de luciferase fendue décrit ici, qui cible les interactions entre les protéines virales et hasS, peut fournir une nouvelle stratégie pour développer des remèdes pour d’autres maladies infectieuses. Bien que notre protocole soit simple et facile à comprendre, certaines étapes peuvent être difficiles à reproduire sans la démonstration visuelle.
Ainsi, la démonstration visuelle sera d’une grande aide pour comprendre notre protocole. Commencez par ensemencer cinq fois 10 à la 5e cellule HEK293T dans un plat de 100 millimètres avec 10 millilitres de DMEM, et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluer un microgramme chacun de HBx-LgBit et SmBit-DDB1 exprimant des plasmides d’ADN et un tampon de condensation d’ADN pour un volume total de 300 microlitres.
Ajouter 16 microlitres de solution enhancer, et mélanger les tubes par vortex pendant une seconde. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes, puis ajouter 60 microlitres de réavenant transfection. Vortex le tube pendant 10 secondes, et incuber l’échantillon pendant encore huit minutes.
Pendant ce temps, aspirer le milieu du plat avec les cellules et les laver avec cinq millilitres de PVS. Aspirer le PVS et ajouter sept millilitres de DMEM. Ajouter trois millilitres de DMEM au tube avec les complexes de transfection, pipette de haut en bas pour mélanger, et ajouter le mélange aux cellules.
Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 10 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture usé et laver les cellules avec cinq millilitres de PVS. Retirez le PVS à un millilitre de 0,25% trypsine EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pour les détacher.
Ensuite, ajouter quatre millilitres de DMEM, et disperser le milieu en le pipetting sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises, et transférer la suspension dans un tube. Centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant, et de suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans un millilitre de PVS. Répétez la cérifugation et jetez le supernatant.
Puis, re-suspendre la pastille cellulaire avec milieu de culture cellulaire tamponné complété par 10%FBS à une densité d’ensemencement d’un million de cellules par millilitre. Pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, et retourner les cellules à l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 10 heures. Pendant que les cellules couvent, diluer les composés de criblage et le solvant à 13,5 X de concentration.
Ajouter 12,5 microlitres de substrat luminescent à chaque puits et incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Mesurez la luminescence de base à l’aide d’un luminomètre, et ajoutez cinq microlitres des composés et dmso contrôlé à chaque puits immédiatement après. Mesurer la luminescence toutes les 30 minutes pendant deux heures, puis calculer les effets inhibiteurs des composés par rapport au traitement DMSO.
Des signaux de luminescence de ligne de base ont été mesurés, et le rapport signal-arrière-plan a été calculé pour être supérieur à 80. Le z prime était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d’analyse est acceptable pour le criblage à haut débit. En fixant le seuil à plus de 40% d’inhibition par rapport au contrôle DMSO seulement, le nitazoxanide a été identifié comme un médicament candidat.
Nous avons précédemment identifié le nitazoxanide comme inhibiteur de l’interaction HBX-DDB1 en sélectionnant une bibliothèque composée à petite échelle réactive avec cette méthode. En utilisant le nitazoxanide, nous confirmons que l’inhibition de l’interaction HBX-DDB1, cette réduction de la transcription virale, et les niveaux de produits viraux ultérieurs. La partie optimale de la luciferase fendue fusionnée à une protéine cible doit être déterminée à l’avance.
Dans ce cas, HPX fusionné à Large Bit au terminus C de HPX et DDB1 fusionné à Small Bit à la fin terminus de DDB1 fourni les meilleurs résultats.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode de criblage d'agents antiviraux contre l'hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1, en utilisant un système de test de luciférine fractionnée. Le protocole permet une détection en temps réel des interactions entre protéines sans lyse cellulaire, facilitant ainsi la découverte de nouveaux agents thérapeutiques destinés à une guérison fonctionnelle du VHB.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Virologie
- Pharmacologie
Contexte
- L'interaction HBX-DDB1 est essentielle à la transcription du VPH à partir de l'ADNcc.
- Les thérapies actuelles contre le VPH présentent des insuffisances que cette méthode vise à corriger.
- La restauration de Smc5/6 par inhibition de HBX-DDB1 peut supprimer la transcription du VPH.
- Le système de test de luciférase divisée fournit un score Z prime élevé, garantissant une qualité de criblage.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant d'identifier des inhibiteurs de l'interaction HBX-DDB1.
- Faciliter la découverte de nouveaux agents thérapeutiques contre le VPH.
- Améliorer l'efficacité et la qualité du criblage en recherche antivirale.
Méthodes utilisées
- Système de dosage de luciférase fractionnée pour la détection des interactions entre protéines.
- Surveillance en temps réel des interactions sans lyse cellulaire.
- Évaluation de la qualité du criblage à l'aide du score Z prime.
- Analyse des mécanismes antiviraux ciblant HBX-DDB1.
Résultats principaux
- La méthode détecte avec succès l'interaction entre HBX et DDB1 en temps réel.
- L'inhibition de l'interaction entre HBX et DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6.
- Une suppression de la transcription du VPH et de la production d'ADNcc a été observée.
- L'approche pourrait fournir un mécanisme antiviral nouveau.
Conclusions
- Cette méthode offre une piste prometteuse pour la découverte de nouveaux traitements contre le VPH.
- Elle remédie aux limites des traitements existants en ciblant HBX-DDB1.
- Le test de luciférase divisée constitue un outil précieux pour les futures recherches antivirales.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'interaction ciblée entre HBx et DDB1 répond à un goulot d'étranglement mécanistique crucial dans la découverte de médicaments contre le virus de l'hépatite B (VHB), permettant une intervention directe au niveau de l'expression des protéines virales. Le système de test de luciférase divisée fournit des mesures quantitatives en temps réel pour le criblage d'inhibiteurs, renforçant la fiabilité prédictive de la validation précoce de la cible. Cette plateforme améliore le tri des projets en permettant l'identification à haut débit de composés dotés de mécanismes antiviraux nouveaux.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe de l'interaction protéine-protéine HBx-DDB1, centrale dans la pathogenèse du VHB.
- Facilite la détection biologique des risques en associant l'inhibition à la restauration de Smc5/6 et à la suppression de la transcription virale.
- Permet une évaluation prédictive de l'engagement de la cible grâce à une mesure en temps réel sur cellules vivantes.
Développement de tests et criblage
- Propose un dosage validé présentant un coefficient Z prime élevé, adapté au criblage à haut débit de composés.
- Fournit des signaux luminescents robustes et quantitatifs permettant un classement fiable des composés.
- Permet des protocoles reproductibles et évolutifs pour le criblage de bibliothèques ciblant les interactions protéine-protéine.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les mécanismes pertinents pour la maladie en ciblant l'expression des protéines virales à partir de l'ADNcc.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en associant l'inhibition moléculaire à des résultats fonctionnels.
- Réduit le risque de translation en se concentrant sur une cible antivirale validée sur le plan mécanistique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce système de test de luciférase fractionnée s'intègre aux stades précoces de la découverte et d'identification des candidats, assurant ainsi un lien entre la validation de la cible et le criblage à haut débit pour le VHB et potentiellement d'autres cibles viraux.
- Découverte biologique : Fournit une plateforme permettant la vérification d'hypothèses sur des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes.
- Écrans de sélection : Offre une prêts à l'essai et une reproductibilité élevés, avec de bonnes valeurs de rapport signal sur fond et de paramètre Z prime.
- Analyse : Génère des données quantitatives d'inhibition permettant de comparer l'efficacité et la sélectivité des composés.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'inhibition moléculaire et la restauration des facteurs de restriction de l'hôte ainsi que la suppression de la transcription virale.
- Réutilisation en milieu professionnel : Adaptable à d'autres cibles d'interactions protéine-protéine dans la recherche sur les maladies infectieuses.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour la découverte de médicaments contre le VHB.
- Valeur opérationnelle : Standardise et accélère les flux de travail de criblage grâce à des résultats robustes et reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller de l'avant, ainsi qu'une progression efficiente en capital de candidats antiviraux innovants.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque de composés dotés de mécanismes d'action uniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les dosages d'interactions protéine-protéine et les mesures de luminescence en cellules vivantes.
- Exige un accès à la culture cellulaire, aux réactifs de transfection et à une infrastructure de luminométrie en plaque.
- Implique une standardisation inter-équipes du montage des dosages et de l'analyse des données pour assurer la reproductibilité.
- Peut nécessiter l'optimisation des constructions de protéines de fusion pour différentes paires cibles.
- Une démonstration visuelle du protocole facilite la reproductibilité des étapes complexes du dosage.
