Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics
29 juin 2020
Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.
Ce protocole présente un flux de travail flexible de PCR de gouttelette de multiplex qui permet le comptage différentiel précis de leukocyte basé sur des marqueurs épigénétiques de méthylation. Cette flexibilité peut faciliter la traduction du mdPCR vers l’utilisation clinique. Cette méthode fournit des résultats qui interrogent étroitement ceux obtenus en utilisant des méthodes de coloration immunofluorescente.
Cependant, contrairement à la coloration immunofluorescente, cette méthode ne nécessite pas d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux. Dans les diagnostics hématologiques, le leucocyte différentiel peut servir d’indicateurs pour un spectre de maladies, y compris l’infection, l’inflammation, l’anémie et la leucémie, et est considéré comme un biomarqueur pronostique tôt de cancer. Christina Nassif, agente technique de notre équipe au Centre de recherche sur les dispositifs médicaux du CNRC, fera la démonstration de l’intervention avec Abdelrahman Elmanzalawy.
Commencez par mélanger soigneusement 20 microlitres de protéine kinase K et 400 microlitres de tampon liant de lyse contenant des perles magnétiques avec les cellules mononucléaires périphériques humaines fraîchement décongelées de sang dans 100 microlitres de PBS. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, placer le tube sur une grille magnétique pendant une à deux minutes avant d’enlever le surnatant. Une fois le tube retiré de l’aimant, suspendez à nouveau le complexe de perles d’ADN dans 600 microlitres de tampon de lavage pour enlever les perles non spécifiquement liées.
Remettre le tube sur l’aimant pour permettre l’enlèvement du supernatant, avant de laver les cellules dans 600 microlitres de tampon de lavage deux comme vient de le démontrer. Après avoir enlevé le supernatant, laissez le tube sécher à l’air libre sur l’aimant pendant une minute avant d’ajouter 100 microlitres de tampon d’élitution au tube avec un mélange complet. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pendant une à deux minutes pour séparer les perles magnétiques de l’ADN mentionné, et transférez la solution d’ADN purifié à un nouveau tube.
Pour la conversion de bisulfite de l’ADN purifié, transférez 20 microlitres de l’échantillon d’ADN mentionné à un tube PCR, et ajoutez 130 microlitres de réaccent de conversion au tube. Après un mélange approfondi, faites tourner brièvement le contenu du tube et amplifiez l’ADN sur un cycleur thermique. À la fin du cycle, ajouter 600 microlitres de tampon liant à une colonne de chromatographie iriontique placée dans un tube de collecte, et ajouter l’ADN à la colonne.
Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger, et centrifugeuse pendant 30 secondes à pleine vitesse. Jetez le flux collecté à travers, et ajouter 100 microlitres de tampon de lavage à la colonne. Centrifugez la colonne et jetez à nouveau le flow-through comme démontré.
Ajouter 200 microlitres de tampon de désulfonation à la colonne pendant une incubation de 15 à 20 minutes à température ambiante, avant de centrifuger l’échantillon et de jeter le débit tel que démontré. Ensuite, lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage par lavage. Après le deuxième lavage, transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajouter 100 microlitres d’eau de qualité PCR à la membrane de la colonne.
Ensuite, élitez l’ADN par centrifugation de la colonne pendant une minute à pleine vitesse. Pour la génération de gouttelettes, mélangez un microlitre d’ADN converti à la bisulfite avec un mélange maître de sonde fraîchement préparé dans un tube PCR, et recueillez l’échantillon avec une brève centrifugation. Utilisez des raccords de pointe pour relier les tubes fluidiques jetables à deux seringues en verre de précision de 250 microlitres.
Et pré-remplir une seringue en verre de précision avec 250 microlitres d’huile porteuse contenant 5% de surfactant flouro, et une seringue en verre de précision avec 50 microlitres d’huile porteuse. Lorsque les deux seringues ont été chargées, chargez 100 microlitres du mélange PCR dans la seringue de l’huile du transporteur et placez un dispositif microfluidique de gouttelette sur la scène d’un microscope à lumière verticale équipé d’une caméra à grande vitesse. Pour l’observation et l’enregistrement de la formation des gouttelettes en temps réel, placez les seringues préfillées sur une pompe à seringues programmable, et utilisez l’union de pointe avec des raccords pour relier le tube des seringues au tube des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique de gouttelette.
Placez le tube de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 millilitre et ajustez le débit de la pompe à seringues à deux microlitres par minute, afin de permettre à la taille de la gouttelette de se stabiliser avant de recueillir l’émulsion qui en résulte. Recueillir lentement et soigneusement l’émulsion du haut du tube, et transférer 75 microlitres de la solution à un tube PCR de 200 microlitres pour le cycle thermique. Ensuite, confirmez que la teneur en huile dans le tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée, pour empêcher la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique, et placez le tube de 200 microlitres dans le cycleur thermique.
Pour l’imagerie par fluorescence de l’échantillon émulsionné, transférez l’émulsion PCR dans un tube capillaire borosilicate profond de 50 micromètres avec un profil rectangulaire, afin de permettre l’arrangement des gouttelettes dans un monocouche emballé près pour l’imagerie. Après avoir fixé et scellé les capillaires sur une lame de microscope, chargez la lame sur la scène du microscope inversé. Et dans le logiciel d’imagerie au microscope, sélectionnez acquérir et vivre rapidement, pour commencer l’acquisition de caméras en temps réel.
Ensuite, observez l’échantillon sous un champ lumineux et une microscopie par fluorescence. Après la production de gouttelettes et le cycle thermique, les gouttelettes peuvent être introduites dans un capillaire en verre d’une largeur d’un millimètre et d’une hauteur de 50 micromètres. Pour obtenir une distribution monocouche des gouttelettes idéale pour l’acquisition d’images de fluorescence, des images peuvent ensuite être enregistrées pour chaque longueur d’onde.
Après analyse d’image, l’intensité de fluorescence de toutes les gouttelettes dans leurs fluorophores respectifs peut être tracée pour établir le seuil des gouttelettes positives et négatives. Après identification et comptage, les copies par gouttelette peuvent être calculées, et le pourcentage de lymphocytes T CD3+, et de lymphocytes T CD4+25+réglementaires peut être déterminé en fonction des copies méthylés de CD3Z et foxp3 respectivement, en ce qui concerne les copies par gouttelette des cellules totales ou du gène sans C. Les valeurs en pourcentage peuvent ensuite être comparées à celles obtenues par imagerie par immunofluorescence à l’aide des anticorps appropriés.
Je pense que la stabilité de l’émulsion de la génération des gouttelettes à travers le cycle thermique et les étapes finales d’imagerie gouttelette est cruciale pour obtenir des résultats de quantification précis, fiables et reproductibles. La personnalisation du PCR MD grâce à une formulation de mélange PCR sur mesure peut être utilisée pour un certain nombre d’applications, y compris la recherche sur le cancer, le diagnostic des maladies infectieuses et l’analyse au niveau d’une seule cellule.
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Aperçu
Ce protocole présente un flux de travail flexible de PCR multiplex en gouttelettes permettant un décompte différentiel précis des leucocytes fondé sur des marqueurs de méthylation épigénétique. Cette méthode fournit des résultats fortement corrélés à ceux obtenus par des méthodes de coloration immunofluorescente.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Hématologie
- Épigénétique
Contexte
- Les marqueurs épigénétiques sont essentiels pour la sous-typage des globules blancs.
- Le comptage différentiel des leucocytes constitue un indicateur de diverses maladies.
- Cette méthode ne nécessite pas d'échantillons de sang frais ni d'anticorps coûteux.
- Elle est envisagée comme un biomarqueur pronostique précoce du cancer.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant un décompte précis des leucocytes différentiels.
- Faciliter la translation de la mdPCR vers une utilisation clinique.
- Proposer une alternative économique à la coloration par immunofluorescence.
Méthodes utilisées
- PCR multiplex en gouttelettes (mdPCR).
- Utilisation d’un dispositif microfluidique à base d’élastomère thermoplastique (TPE).
- Quantification des profils de méthylation de l’ADN.
- Démonstration par un agent technique du Centre de recherche sur les dispositifs médicaux du CNRC.
Résultats principaux
- La méthode mdPCR permet une quantification précise et multiplexe des cibles spécifiques à la méthylation.
- Les résultats correspondent étroitement à ceux obtenus par les méthodes traditionnelles.
- Cette méthode est adaptable aux applications cliniques.
- Elle peut servir d'outil diagnostique fiable pour diverses affections hématologiques.
Conclusions
- La méthode mdPCR est un outil prometteur pour le comptage différentiel des leucocytes.
- Elle présente des avantages par rapport à la coloration immunofluorescente traditionnelle.
- Cette approche pourrait améliorer les capacités diagnostiques en hématologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole de PCR multiplex en gouttes permet un décompte différentiel précis des leucocytes basé sur l'épigénétique, offrant une alternative économique à la coloration par immunofluorescence pour le diagnostic hématologique. En quantifiant les profils de méthylation de l'ADN au niveau des sites CpG, cette méthode soutient la découverte de biomarqueurs pronostiques dans des maladies telles que les infections, les inflammations, les anémies et les leucémies. Sa compatibilité avec les échantillons archivés et l'élimination de la dépendance aux anticorps renforcent son potentiel translationnel pour une mise en œuvre en laboratoire clinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de marqueurs épigénétiques afin de valider des hypothèses sur les sous-populations de globules blancs dans des modèles de maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit des lectures quantitatives spécifiques à la méthylation qui réduisent les risques liés aux évaluations de l'engagement des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données épigénétiques standardisées et multiplexées pour assurer la reproductibilité des tests au cours de campagnes de criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Permet la génération à haut débit de gouttelettes de taille constante pour une détection fiable basée sur la fluorescence.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la sous-classification des globules blancs alignée sur les biomarqueurs, assurant une continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique.
- Valeur opérationnelle : Permet la détermination paramétrique des populations de cellules immunitaires à l'aide de signatures épigénétiques, réduisant ainsi la dépendance aux marqueurs de surface cellulaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en fournissant une quantification épigénétique qui éclaire les décisions de validation de cibles et d'identification de composés d'intérêt.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur l'implication des cellules immunitaires par l'analyse des profils de méthylation de sites CpG spécifiques.
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles de PCR en gouttelettes, permettant la comparaison des réponses épigénétiques entre différentes conditions expérimentales.
- Analytique : Génère des mesures du nombre de copies par gouttelette et une classification seuil des gouttelettes en positives/négatives pour une quantification précise des populations cellulaires.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans le développement de biomarqueurs pronostiques en corrélant les comptages épigénétiques de globules blancs avec les résultats cliniques dans les affections hématologiques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'analyse épigénétique multiplexe, applicable dans les domaines de l'immunologie, de l'oncologie et des maladies infectieuses.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la quantification des sous-populations de cellules immunitaires grâce à la spécificité épigénétique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l’extensibilité par l’utilisation d’un dispositif microfluidique en élastomère thermoplastique et d’une génération normalisée de gouttelettes.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques en phase tardive en permettant une surveillance immunitaire précoce, sans anticorps, dans les modèles précliniques.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire les décisions d’avancement ajustées au risque grâce à un profilage immunitaire objectif fondé sur la quantification.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conversion au bisulfite, en PCR en gouttelettes et en analyse d'imagerie de fluorescence.
- Dépend de seringues en verre de précision, de pompes à seringue programmables et de dispositifs microfluidiques en élastomère thermoplastique.
- Exige une standardisation de la formulation du mélange maître de sondes et des paramètres de cyclage thermique entre les différents sites.
- Les considérations d'adaptation incluent des panels cibles de CpG variables selon les sous-populations de globules blancs et les contextes pathologiques.
- Les limitations pratiques comprennent le maintien de la stabilité de l'émulsion durant les étapes de cyclage thermique et d'imagerie afin d'éviter la coalescence.
