Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae
9 novembre 2020
Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), une centrifugation de gradient de glycérol en présence d’un réticulateur, pour identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe d’épissage.
La méthode de fixation par gradient, dans laquelle une centrifugation par gradient de glycérol est effectuée en présence d’un agent de réticulation, permet d’identifier les interactions entre les protéines qui se lient transitoirement à des complexes multi-sous-unités. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison des facteurs lâches, sans formation de précipités, permettant l’identification des interactions de protéines spécifiques avec des semi-complexes épissés. La démonstration du protocole final aide les nouveaux utilisateurs à apprendre des informations qui peuvent être difficiles à comprendre à partir d’un texte écrit seul.
Pour la préparation de l’extrait total de levure, cultivez les cellules de levure en exprimant l’un des facteurs d’épissage fusionnés à l’étiquette de robinet et un litre de milieu de glucose Y et B complété par les acides aminés appropriés ou les bases nucléiques. Lorsque la culture atteint une densité optique de 600 nanomètres de un, collectez les cellules de levure par centrifugation dans trois bouteilles de centrifugeuse de 500 millilitres, et lavez les cellules deux fois dans 10 millilitres d’eau froide stérile par lavage. Après le deuxième lavage, remettez les cellules en suspension dans un dixième du volume cellulaire du tampon froid A et congelez 50 gouttes d’un microlitre de suspension de cellules de levure dans de l’azote liquide.
Après la congélation, broyez les granulés de cellules congelées en six cycles à 20 hertz pendant trois minutes dans un broyeur à boulets, en immergeant le récipient de cellules congelées dans de l’azote liquide à la fin de chaque cycle. Après le dernier cycle, placez les tubes contenant les extraits dans de l’eau à température ambiante en secouant de temps en temps. Une fois fondus, centrifuger pour recueillir les extraits.
Et quantifier la protéine qui a éliminé les surnageants par la méthode BCA. Ensuite, congelez rapidement les aliquotes des extraits dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer un gradient de glycérol, ajoutez une concentration finale de 0,1 % de l’agent de réticulation glutaraldéhyde à une solution de glycérol et de tampon A à 30 %, et mélangez pour homogénéiser.
Ajoutez six millilitres de solution froide de glycérol à 10 % et de tampon A dans un tube à centrifuger de 12 millilitres et utilisez une seringue à gradient master équipée d’une longue aiguille pour superposer la solution de glutaraldéhyde à 30 % de glycérol au fond du tube. Utilisez un appareil maître de gradient pour créer un gradient linéaire de glycérol selon les spécifications du fabricant. Superposez soigneusement 200 microlitres d’un coussin de glycérol à 7 % et tamponnez A au sommet du gradient avant d’ajouter environ deux milligrammes d’extrait cellulaire au sommet du tube.
Après la génération du gradient de glycérol, placez l’échantillon dans un rotor à godet pivotant pré-refroidi et collectez l’extrait par centrifugation. Séparez l’échantillon de chaque tube d’échantillon de 12 millilitres en fractions de 24 500 microlitres et utilisez une pompe péristaltique pour pousser une solution de glycérol à 40 % à travers le gradient de 10 à 30 % entre le tube et la collecte des fractions. Ensuite, chargez 50 microlitres de chaque fraction directement sur les membranes de nitrocellulose sur un dot blot, suivi de l’ajout d’un tampon de blocage, et utilisez un anticorps primaire contre le CBP pour détecter la protéine sur l’immuno-blot, et un anticorps secondaire approprié si nécessaire.
En l’absence de réticulant, CWC 24 est concentré entre les fractions cinq et 13, ce qui correspond à des complexes d’environ 80 à 200 mégadaltons. En présence de l’agent de réticulation, cependant, la position de CWC 24 sur le gradient est décalée vers les fractions au bas du gradient correspondant à des complexes plus grands. En comparant la sédimentation de la CWC 24 à celle de la sous-unité snRNP U5, Prp8, et de la sous-unité NTC, Prp19, on constate que la CWC 24 est concentrée dans les mêmes fractions.
Mais, parce qu’il s’associe transitoirement à l’épissage, il est également présent dans les fractions plus légères. Il est intéressant de noter que les fractions 11 et 12 sont celles dans lesquelles Prp8 et 19 commencent à se concentrer, ce qui suggère qu’il s’agit de la partie du gradient où le complexe B Act commence à se sédimenter. L’analyse par transfert Western des fractions 11 et 12 révèle que les signaux Prp8 et 19 sont des frottis qui pénètrent à peine dans un gel d’acrylamide à 8 %, ce qui montre qu’ils font effectivement partie de grands complexes.
CWC 24 est également présent dans la fraction 12, mais à une concentration beaucoup plus faible, ce qui correspond à sa liaison transitoire au complexe B Act. Pris ensemble, ces résultats montrent que le glutaraldéhyde peut être utilisé comme réticulant pour stabiliser la liaison des facteurs transitoires aux sous-complexes d’épissage. Cette méthode peut être appliquée à l’étude de tout complexe de sous-unités motrices dynamiques qui s’associe transitoirement à certaines de leurs composantes, comme l’épissage.
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Aperçu
Cet article décrit la méthode de fixation par gradient, utilisant une centrifugation sur gradient de glycérol avec un agent réticulant afin d'identifier les interactions transitoires entre les facteurs d'épissage et le complexe spliceosome. Cette méthode stabilise les interactions protéiques faibles sans formation de précipité, facilitant ainsi l'étude des interactions protéiques spécifiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
Contexte
- La fixation par gradient est une technique utilisée pour étudier les interactions entre protéines.
- Elle permet d'identifier les interactions transitoires au sein de complexes multi-sous-unités.
- L'utilisation de réactifs de réticulation améliore la stabilité de ces interactions.
- Cette méthode est particulièrement utile pour l'étude des facteurs d'épissage.
Objectif de l'étude
- Démontrer la méthode de fixation en gradient pour identifier les interactions protéiques.
- Fournir un protocole qui aide les nouveaux utilisateurs à comprendre la technique.
- Faciliter l'étude des facteurs d'épissage chez la levure.
Méthodes utilisées
- Centrifugation sur gradient de glycérol avec un agent de réticulation.
- Préparation d'extraits totaux de levure exprimant des facteurs d'épissage.
- Récupération et lavage des cellules de levure.
- Concentration des suspensions cellulaires pour analyses ultérieures.
Résultats principaux
- La méthode stabilise avec succès les interactions protéiques transitoires.
- Des interactions spécifiques entre les facteurs d'épissage et le spliceosome ont été identifiées.
- Le protocole est accessible aux chercheurs novices dans la technique.
- La démonstration du protocole final facilite la compréhension pratique.
Conclusions
- La fixation par gradient est une méthode efficace pour étudier les interactions transitoires entre protéines.
- Cette technique peut améliorer notre compréhension des mécanismes d'épissage.
- Elle fournit un outil précieux aux chercheurs en biologie moléculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'identification des interactions transitoires entre protéines est essentielle pour la validation des cibles dans des complexes dynamiques comme le spliceosome, où des associations faibles ou de courte durée peuvent être manquées par des méthodes conventionnelles. La méthode Grafix (Gradient Fixation) stabilise ces interactions à l'aide d'une centrifugation sur gradient de glycérol en présence d'un agent de réticulation, permettant leur détection sans formation de précipité. Cette approche soutient la réduction des risques mécanistiques en précisant les partenaires d'interaction dans des systèmes pertinents pour la maladie, améliorant ainsi la confiance prédictive lors des premières étapes de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse d'interactions transitoires entre facteurs d'épissage qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques dans les voies de traitement de l'ARN.
- Valeur opérationnelle : Stabilise les faibles affinités pour leur détection, réduisant ainsi les faux négatifs dans les essais de validation de cibles.
- Valeur scientifique : Facilite la clarification des voies en cartographiant la cosédimentation de facteurs tels que CWC 24 avec l'U5 snRNP et les sous-unités du NTC.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des complexes fractionnés pour des analyses en aval par immunotransfert sur membrane, permettant une évaluation quantitative de la présence de facteurs d'épissage.
- Valeur opérationnelle : Génère des profils de sédimentation reproductibles qui peuvent être standardisés entre les expériences afin d'assurer la cohérence des dosages.
- Valeur scientifique : Facilite la préparation au criblage en isolant des sous-complexes dans des fractions définies du gradient pour une analyse ciblée.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit des informations pertinentes sur la dynamique du spliceosome, impliquée dans les cancers et les troubles neurodégénératifs.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en stabilisant les interactions transitoires pour un suivi fonctionnel.
- Valeur scientifique : Facilite la détection mécanistique des risques en distinguant les associations stables de celles qui sont transitoires dans les machines macromoléculaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode Grafix s'inscrit dans la phase initiale de la découverte, en soutenant la vérification d'hypothèses sur des interactions transitoires avant de passer à l'identification de composés candidats et à la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses concernant la liaison transitoire de facteurs d'épissage en stabilisant les interactions pour leur détection dans les fractions de gradient.
- Écrantage : Produit des fractions prêtes à l'essai à l'aide de gradients de glycérine standardisés, permettant un écrantage reproductible de composés ou de facteurs.
- Analytique : Fournit des données quantitatives de sédimentation et des résultats de co-localisation (par exemple, CWC24 avec Prp8/Prp19) pour comparer des conditions et évaluer les décalages de liaison.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique en identifiant des facteurs dont la liaison transitoire pourrait être modulée dans des états pathologiques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude de tout complexe dynamique de sous-unités comportant des composants transitoires, sans être limitée au spliceosome.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en révélant des intermédiaires transitoires habituellement perdus dans les lysats standards.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à une génération standardisée des gradients et à une fractionnation reproductible, réduisant ainsi la variabilité entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Affine les décisions de poursuite ou d'abandon en clarifiant les ambiguïtés mécanistiques au sein de complexes cibles multi-sous-unités.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des réseaux d'interactions validés dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en lyse des cellules de levure, en préparation de gradients et en techniques de fractionnement.
- Dépend de l'accès à des dispositifs maîtres de gradient, à des rotors à godets oscillants et à du matériel de fractionnement.
- Exige une standardisation de la concentration de l'agent de réticulation (par exemple, le glutaraldéhyde) afin d'éviter une sur-stabilisation ou une précipitation.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application à des systèmes non levuriques ou à des complexes alternatifs.
- Comprend des limites pratiques telles que le masquage potentiel d'épitopes par la réticulation, nécessitant une validation de l'accessibilité des anticorps après fixation.
