Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement
1 juin 2021
Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.
Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique qui révèle des détails moléculaires sur l’activité des ribosomes à l’intérieur de la cellule. Cette technique permet aux utilisateurs d’obtenir les informations précieuses fournies par un profil polysomique, qui n’ont pas accès à des systèmes automatisés de fractionnement de gradient. Prenez votre temps lors de la préparation des gradients et stockez les gradients dans un endroit où ils ne seront pas perturbés par un compresseur ou d’autres opérations mécaniques lorsqu’ils s’installent dans une pente linéaire.
Pour commencer, préparez des solutions mères de 7 et 47% de saccharose dans un tampon de gradient de saccharose. Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 micron. Préparer 14 millilitres de solutions de saccharose à 17, 27 et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions mères à 7 et 47 %.
Placez six tubes centrifuges en polypropylène dans un support de tube à essai à vue intégrale. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace entre les tubes pour que les actions avec un tube ne perturbent pas les autres. Fixez une aiguille de calibre 22 de neuf pouces avec une pointe émoussée à une seringue de trois millilitres, et effectuez un remplissage et une distribution d’essai pour s’assurer que la seringue peut contenir la solution de saccharose sans goutte avant de mettre en place les gradients.
Ajouter deux millilitres de saccharose à 7% au fond de chaque tube de centrifugation. Ensuite, ajoutez deux millilitres du saccharose à 17% sous la solution à 7%, en positionnant l’extrémité de l’aiguille à proximité immédiate du fond du tube. Distribuez soigneusement et lentement la solution.
Répétez la procédure avec deux millilitres chacun de la solution de saccharose à 27, 37 et 47%, en veillant à ce que chaque couche se distingue de l’autre par une ligne marquant la séparation des densités. Conservez les gradients à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour leur permettre de se déposer dans un pourcentage continu et croissant de saccharose. Après la croissance et la récolte de la levure, les cellules de Saccharomyces cerevisiae remettent les cellules en suspension dans 700 microlitres réfrigérés de tampon d’extraction de polysomes.
Ajouter 100 unités d’inhibiteur de l’ARNase. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de billes de verre pré-refroidies d’une taille approximative de 425 à 600 microns. Transférer le mélange dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre avec les billes de verre et perturber les cellules de levure par une agitation vigoureuse dans un batteur à billes pendant cinq minutes.
Après avoir perturbé les cellules, clarifier le lysat par centrifugation. Déterminer la concentration de l’ARN dans le lysat clarifié en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres, à l’aide d’un système de détection d’ARN basé sur la fluorescence. Assurez-vous que la concentration d’ARN est de 0,5 à un microgramme par microlitre.
Si la concentration d’ARN est trop faible, réduire le volume du tampon d’extraction utilisé pour remettre les cellules en suspension. Chargez soigneusement le lysat sur le dessus des dégradés. Placez l’embout de la pipette contre la paroi intérieure au sommet du tube en polypropylène.
Inclinez le tube et distribuez lentement le lysat sur le dessus de la pente, en dribblant contre le mur. Placez délicatement les tubes dans les godets pré-refroidis d’un rotor de godet oscillant et centrifugez les gradients. Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes de centrifugation du rotor du godet oscillant et placez-les dans un support de tube.
Étiqueter les plaques de 96 puits pour stocker les fractions et prérefroidir sur de la glace. Recueillir 100 ou 200 fractions de microlitres en partant du haut du gradient, en insérant soigneusement une pointe de pipette dans le haut du gradient, et en recueillant les fractions jusqu’à ce que tout le dégradé soit aliquote. Mesurer l’absorbance de chaque fraction à 254 nanomètres avec un spectrophotomètre par rapport aux solutions de saccharose à 7 et 47% sous forme d’ébauches.
Créez le profil polysomique en traçant le nombre de fractions en fonction de l’absorbance. Trois profils polysomiques représentatifs de la levure S.Cerevisiae, sont présentés. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic polysomique est apparente sur chaque profil.
Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité est présenté ici. Ce profil a été produit à partir d’un profil d’absorbance continue lorsque le gradient de saccharose a été déplacé de bas en haut par une solution de chasse, à travers une cellule d’écoulement du détecteur et recueilli en fractions. Le profil polysomique généré par fractionnement manuel d’échantillons de 200 et 100 microlitres est présenté ici.
La chose la plus importante à retenir avec cette procédure est de ne pas perturber les gradients. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air ou perturber le gradient en distribuant la solution trop rapidement. En suivant cette procédure, l’ARN peut être extrait des gradients pour une analyse plus approfondie afin de déterminer les ARNm qui s’associent à des ribosomes actifs.
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Aperçu
Ce protocole décrit comment générer un profil de polysomes qui révèle les détails moléculaires concernant l'activité des ribosomes à l'intérieur de la cellule. Cette technique permet aux utilisateurs d'obtenir des informations précieuses sans recourir à des systèmes automatisés de fractionnement de gradients.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
Contexte
- Le profilage des polysomes est essentiel pour comprendre l'activité ribosomique.
- Il fournit des informations sur la traduction et l'expression génique.
- Les systèmes automatisés ne sont pas toujours accessibles aux chercheurs.
- Ce protocole propose une méthode alternative pour la préparation de gradients.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode détaillée pour générer des profils de polysomes.
- Faciliter l'analyse de l'activité ribosomique dans divers contextes de recherche.
- Permettre aux chercheurs ne disposant pas de systèmes automatisés d'effectuer cette analyse.
Méthodes utilisées
- Préparation des solutions en gradient de saccharose.
- Filtration des solutions mères de saccharose.
- Maclage progressif de concentrations de saccharose différentes.
- Stockage soigneux des gradients afin d'en maintenir la stabilité.
Résultats principaux
- Génération réussie d'un gradient linéaire de saccharose.
- Capacité à analyser l'activité ribosomique sans systèmes automatisés.
- Offrir une méthode fiable pour le profilage des polysomes.
- Apport d'informations sur les mécanismes moléculaires de la traduction.
Conclusions
- Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs.
- Il facilite l'accès à la technique de profilage des polysomes.
- Des études ultérieures peuvent s'appuyer sur cette méthode pour diverses applications.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le profilage des polysomes permet une détection mécanistique des risques lors de la validation des cibles en révélant l'activité traductionnelle d'ARNm spécifiques, renforçant ainsi la confiance prédictive en phase précoce de découverte. Ce protocole décrit une méthode économique et reproductible pour obtenir des profils de ribosomes à l'aide d'équipements de laboratoire standards, élargissant ainsi l'accès à l'analyse de biomarqueurs traductionnels dans les contextes à ressources limitées. Il permet d'intégrer cette approche dans le flux opérationnel, depuis le test d'hypothèses jusqu'à l'identification de candidats thérapeutiques, en permettant une évaluation quantitative de l'engagement ribosomique sans dépendre de systèmes de fractionnement coûteux.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroger des hypothèses thérapeutiques en identifiant les ARNm activement associés aux ribosomes dans des conditions expérimentales.
- Valeur opérationnelle : Permettre une validation fonctionnelle des cibles grâce à la mesure directe du rendement de traduction dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur prédictive : Soutenir le tri du portefeuille en corrélant les décalages des polysomes avec la modulation des voies et l'engagement des cibles.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Préparer des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en établissant des profils traductionnels de base.
- Reproductibilité : Générer des gradients de saccharose reproductibles sans équipement spécialisé, assurant une fractionnement fiable pour l'analyse comparative.
- Données quantitatives : Mesurer l'absorbance à 254 nm afin d'obtenir des profils de polysomes quantifiables, permettant la validation des hits et l'évaluation de la réponse dose-dépendante.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Adapter le protocole à divers types cellulaires afin d'étudier la dysrégulation traductionnelle dans des modèles précliniques.
- Réduction des risques mécanistiques : Corréler la modulation de la cible avec des modifications du profilage des ribosomes, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme d'action.
- Continuité translationnelle : Faciliter l'alignement des biomarqueurs en extrayant l'ARN à partir des fractions pour identifier les ARNm associés aux ribosomes actifs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, permettant le profilage des ribosomes comme indicateur fonctionnel avant l'engagement en phase préclinique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en révélant quels transcrits sont activement traduits, précisant ainsi l'implication des voies au-delà des modifications transcriptionnelles.
- Écrans : Permet la standardisation des tests grâce à la génération reproductible de gradients, autorisant une comparaison fiable des effets des composés sur la production traductionnelle.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (absorbance à 254 nm) permettant aux équipes de comparer l'engagement ribosomique entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en permettant l'extraction d'ARN associés aux polysomes pour une analyse approfondie des biomarqueurs régulés au niveau traductionnel.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable d'analyse de l'activité ribosomique à travers différents projets, réduisant la dépendance vis-à-vis des plateformes centrales mutualisées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la mesure directe de l'activité traductionnelle, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité de la préparation des gradients à l’aide d’équipements de laboratoire accessibles.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d’avancement ou d’abandon en permettant une évaluation précoce de l’engagement de la cible au niveau traductionnel.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque basée sur les données de profilage des polysomes, réduisant les risques biologiques en phase avancée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la préparation des gradients et une manipulation soigneuse afin d'éviter toute perturbation des couches de saccharose.
- Suppose l'accès à un rotor à godets oscillants, à un spectrophotomètre et à un broyeur à billes pour la préparation des lysats.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de collecte des fractions et de mesure de l'absorbance.
- Implique des adaptations spécifiques lors de l'application à des cellules de mammifères ou de plantes, en raison des différences dans la lyse cellulaire et la stabilité des polysomes.
- Limite pratique : la fractionation manuelle est moins performante que les systèmes automatisés, ce qui la rend adaptée à la validation plutôt qu'au criblage à haut débit.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of 7 to 47% Sucrose Gradients
2:14
Preparation of Yeast Cell Extracts
3:21
Centrifugation of Gradients
3:49
Fraction and Data Collection
4:36
Results: Polysome Profiling Without Gradient Makers or Fractionation Systems
5:19
Conclusion
