Microscopie à fluorescence pour l’internalisation de l’ATP médiée par la macropinocytose dans les cellules tumorales humaines et les souris xénogreffées

Les cellules cancéreuses ont une capacité remarquable à internaliser les nutriments, tels que l’ATP, de l’environnement extracellulaire. Notre protocole nous permet de démontrer l’internalisation de l’ATP et de visualiser la localisation de l’ATP dans les cellules. Cette imagerie haute résolution de l’ATP internalisé, au sein des macropynozomes, est idéale pour comprendre la localisation spéciale et compléter la quantité d’analyse de l’internalisation.

Le protocole décrit différentes applications expérimentales pour étudier l’internalisation de l’ATP. Cette méthode peut être utilisée pour étudier différents mécanismes d’internalisation cellulaire, y compris la macropinocytose et l’endocytose médiée par les exosomes. Pour les maladies métaboliques, l’internalisation de l’ATP dans les cellules non cancéreuses peut être étudiée avec ce protocole.

Pour commencer, ensemencez les cellules cancéreuses dans une fiole de 225 centimètres carrés, contenant du DMEM complété par du FBS et des antibiotiques. Permettre aux cellules de croître à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans l’incubateur de culture cellulaire. Une fois la confluence de 80% atteinte, détachez les cellules et abattez les cellules par centrifugation, et remettez les cellules en suspension dans du PBS glacé pour atteindre la densité cellulaire de 5 fois 10 à 6 cellules pour 100 microlitres de PBS.

Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Nettoyez le site d’injection sur le flanc d’une souris immunodéficiente, avec de l’éthanol à 75%, et essuyez l’excès d’éthanol avec une lingette délicate. Aspirez les cellules dans une seringue sans latex d’un millilitre, équipée d’une aiguille de glissement de précision de calibre 27.

Pour l’injection sous-cutanée, maintenez l’aiguille à un angle d’environ 10 degrés par rapport à la peau et insérez la pointe de l’aiguille avec le biseau tourné vers le haut sous la peau, en ne gardant qu’un à deux millimètres de l’aiguille à l’extérieur de la peau. Distribuer les cellules de la seringue lentement pendant environ 10 secondes. Après avoir injecté tout le volume, maintenez l’aiguille en place pendant trois à cinq secondes, puis retirez l’aiguille.

Appliquez une pression douce mais ferme sur le site d’injection pendant trois à cinq secondes avec les doigts, pour éviter toute fuite du contenu injecté. Surveillez et mesurez la croissance tumorale à l’aide d’étriers Vernier, jusqu’à ce que les tumeurs atteignent un volume de 200 à 500 millimètres cubes. Dissoudre 300 microlitres de 16 milligrammes par millilitre de dextran fluorescent de haut poids moléculaire et DMEM sans sérum, et incuber dans un bain-marie, tempéré à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis centrifuger la solution de dextran et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

À 40 microlitres, un millimolaire non hydrolysable fluorescent ATP analogique à 160 microlitres de DMEM sans sérum, pour faire une solution d’ATP fluorescente non hydrolysable de 0,2 millimolaire. Préparer les solutions de traitement de DMEM ou de huit milligrammes par millilitre de dextran fluorescent de haut ou de bas poids moléculaire, avec ou sans ATP fluorescent micromolaire non hydrolysable dans du DMEM, en mélangeant les solutions mères préparées précédemment. Utilisez une seringue d’un millilitre pour recueillir 50 microlitres d’une solution de traitement.

Injecter la solution directement dans la tumeur de xénogreffe et répéter pour quatre répliques biologiques de chaque traitement. Après avoir euthanasié la souris et isolé le tissu tumoral, utilisez une cuillère perforée pour ramasser le tissu tumoral réséqué et placez immédiatement le tissu dans un milieu de congélation et roulez le tissu, en veillant à ce que le tissu reste immergé dans les bains moyens, toutes les surfaces tissulaires. Placez soigneusement le tissu dans le moule d’encastrement contenant le milieu de congélation.

Placez l’étiquette correspondante verticalement dans le support de congélation ou le moule, en vous assurant que l’étiquette écrite est visible à l’extérieur du support. Lorsque le milieu de congélation devient blanc opaque, retirez le bloc de tissu du moule, placez le bloc de tissu sur de la glace carbonique et répétez la congélation pour chaque section de tumeur. Conservez les blocs de tissus à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs mois avant la procédure de cryosection.

Après avoir fait les lames des blocs de tissu, fixez les lames de la section de tissu dans de l’éthanol à 95% à moins 18 degrés Celsius pendant cinq minutes. Lavez la section fixe avec PBS pendant cinq minutes. Ajouter 10 à 50 microlitres d’un milieu de montage aqueux avec DAPI aux sections de tissu, selon la taille des sections, et placer un couvercle en verre glisser sur la section de tissu.

Après 12 à 24 heures de montage, identifiez les régions d’intérêt des sections tumorales fixes et acquérez les images en utilisant la microscopie à fluorescence comme démontré précédemment. Après deux à 24 heures de fixation des cellules tumorales humaines et debout avec DAPI, capturez les images à l’aide d’un système d’imagerie par épifluorescence et d’un logiciel d’acquisition de données. Placez la lame sur la scène d’un microscope à épiflorescence verticale en mode binoculaire.

Ouvrez le programme d’imagerie, sélectionnez l’objectif 10 fois et ajustez la scène pour définir la mise au point. Scannez la diapositive de gauche à droite de manière serpentine pour identifier les régions d’intérêt. Sélectionnez l’objectif 40 fois et utilisez la bascule du microscope pour passer du mode binoculaire au mode de capture d’image.

Cliquez sur l’icône de qualité en direct pour afficher et ensuite acquérir les images. Utilisez le panneau OC de la barre d’outils d’acquisition pour définir les paramètres d’exposition de chaque cube de filtre ou canal fluorescent, puis utilisez la barre d’outils d’acquisition multicanal pour acquérir une image à trois canaux avec les paramètres d’exposition définis. Alternativement, les images multicanaux peuvent être acquises manuellement en basculant entre les cubes de filtre, en réglant le temps d’exposition, en fermant ou en ouvrant l’obturateur entre l’acquisition d’image pour chaque canal et en superposant chaque image prise pour des canaux individuels.

Enregistrez l’image en tant que fichier nd2. Enregistrez les fichiers TIF, y compris l’image de canal fusionnée et les images de canal individuelles. Utilisez la fonction de comptage d’objets de la barre d’outils d’annotations et de mesures pour compter le nombre de cellules NHF-ATP, TMR dextran fluorescent de haut poids moléculaire et TMR fluorescent de dextran positif de faible poids moléculaire sur un fichier image nd2 enregistré et exporter les données vers une feuille de calcul via le programme d’analyse.

Ce protocole a été développé pour l’analyse spatiale, temporelle et quantitative de l’internalisation cellulaire de l’ATP non hydrolysable. L’internalisation intracellulaire de l’ATP fluorescent non hydrolysable a été démontrée par colocalisation de l’ATP fluorescent non hydrolysable avec du dextran fluorescent de haut ou bas poids moléculaire in vitro, ex vivo et in vivo. Pour s’assurer que les cellules tumorales conservaient l’ATP internalisé, le temps expérimental a limité toutes les injections intratumorales à la cryo-intégration.

Tenez également compte de la variation intratumorale en imageant le tissu dans toute la tumeur. Les futures itérations de notre méthode pourraient impliquer une visualisation en temps réel du processus d’internalisation de l’E-ATP, révélant des informations sur la cinétique macropynocytotique et le trafic dans des tissus spécifiques.