Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Notre protocole décrit une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique. L’utilisation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium peut être facilement préparée et visualisée à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. Contrairement aux tranches opaques d’os ou de dentine, le revêtement de phosphate de calcium permet de visualiser les fosses de résorption et les cellules en même temps.

Dans ce protocole, nous utilisons des PBMC pour la différenciation des ostéoclastes. Cependant, il peut également être appliqué à d’autres types de cellules comme les monocytes dérivés de la moelle osseuse ou les cellules Raw 264.7. Prenez d’abord une plaque de culture cellulaire à fond plat de 96 puits et pipettez 300 microlitres de solution de phosphate de calcium préalablement préparée dans chaque puits.

Ensuite, couvrez la plaque avec le couvercle et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Après trois jours, aspirer la solution de pré-calcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées de 96 puits et ajouter 300 microlitres de solution de phosphate de calcium à chaque puits. Couvrez les plaques avec un couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant une journée.

Ensuite, inversez la plaque pour verser la solution et lavez soigneusement la plaque trois fois avec de l’eau désionisée. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou de dioxyde de carbone comprimé ou d’azote gazeux pour maintenir une surface uniforme. Maintenant, irradiez la plaque enduite sur un banc propre avec des rayons ultraviolets pendant une heure.

Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec Parafilm et conservez-la à température ambiante. Diluer 15 millilitres de sang frais avec un volume égal de PBS et les mélanger en inversant ou en piquant plusieurs fois. Ensuite, prenez 15 millilitres de solution de gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres, inclinez le tube et superposez soigneusement 30 millilitres d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 millilitres.

Plus tard, centrifugez le tube dans un rotor à godet oscillant sans casser à 810 fois G pendant 20 minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, aspirez la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire intacte à l’interface. Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Remplissez le tube avec du PBS, mélangez et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Remettez en suspension les PBMC dans un alpha-MEM complet contenant 20 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages, et ensemencez 2,5 fois 10 à cinq cellules par centimètre carré de PBMC dans une fiole. Incuber les plaques enduites de phosphate de calcium avec 50 microlitres de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, lavez la fiole deux fois avec du PBS pour détacher les précurseurs d’ostéoclastes des cellules mortes ou non adhérentes, puis ajoutez quatre millilitres de trypsine par flacon de 75 centimètres carrés. Après 30 minutes, arrêtez la digestion en ajoutant quatre millilitres d’alpha-MEM complet, puis détachez soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et comptez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de comptage.

Centrifugez le tube à 350 fois G pendant sept minutes pour granuler les cellules et remettre en suspension la pastille et complétez l’alpha MEM contenant M-CSF et RANKL pour obtenir une fois 10 à six cellules par millilitre. Aspirer le sérum bovin fœtal de la plaque enduite de phosphate de calcium et pipeter 200 microlitres de suspension cellulaire par puits. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS.

Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes et lavez-les à nouveau avec du PBS. Pour la coloration, ajoutez un tampon de perméabilisation aux cellules fixes et incuubez-les pendant cinq minutes. Pour colorer les filaments d’actine, incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de phalloïdine marquée Alexa Fluor 546 dans du PBS pendant 30 minutes, puis aspirer la solution de coloration et colorer les noyaux à l’aide de 100 microlitres de Hoechst pendant 10 minutes.

Coloration en phosphate de calcium avec 100 microlitres de 10 micromolaires de calccéine micromolaire et de PBS pendant 10 minutes. Après avoir lavé trois fois avec PBS, capturez des images. Pour la coloration Von Kossa du revêtement de phosphate de calcium, ajoutez 50 microlitres de nitrate d’argent à 5% et d’eau désionisée à chaque puits, et incubez la plaque sous rayonnement ultraviolet pendant une heure jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.

Le revêtement de phosphate de calcium au fond des 96 plaques de puits semblait uniforme et bien adhérent. Après neuf jours de culture dans le M-CSF et le RANKL sur les plaques revêtues de phosphate de calcium, les précurseurs d’ostéoclastes ont formé des fosses de résorption et de grands ostéoclastes. Les ostéoclastes multinucléés situés dans les fosses exprimaient des niveaux élevés de TRAP.

Les ostéoclastes matures ont montré la présence de trois noyaux ou plus et de l’anneau d’actine distinct. Le revêtement de phosphate de calcium vert a montré la présence de fosses de résorption noires. Les images de fluorescence de la zone de fosse ont été mesurées à l’aide de l’outil de seuil de l’image J.Le nombre et la taille des ostéoclastes ont été calculés à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement et de l’outil de sélection de polygones de l’image J.Les précurseurs des ostéoclastes cultivés en l’absence de RANKL ne pouvaient pas former de fosses de résorption, mais M-CSF et RANKL ont facilité la formation de fosses ostéoclastogènes.

Et la zone de la fosse a été quantifiée à l’aide de l’image J.Le séchage immédiat de la plaque revêtue avec un flux d’air aide à créer un revêtement uniforme de phosphate de calcium. Sinon, il est susceptible de former un revêtement plus épais au milieu du puits.