Détermination de l’efficacité d’accouplement des haploïdes chez Saccharomyces cerevisiae

Ce protocole est une méthode simple pour quantifier l’efficacité avec laquelle différentes souches et espèces de levures s’accouplent les unes aux autres. La méthode proposée est simple, robuste et efficace. La méthode peut être étendue à n’importe quelle souche de levure.

La méthode décrite dans cette étude peut être utilisée pour comprendre comment la spéciation se produit dans la levure. De plus, les souches que nous décrivons peuvent être particulièrement utiles pour concevoir des expériences avec le flux génétique. La force de la méthode est qu’elle est vraiment simple.

Quelques légers ajustements comme le temps d’incubation peuvent être nécessaires en fonction de la souche particulière utilisée. Commencez à faire revivre les haploïdes A et Alpha des bouillons congelés en striant l’inoculum de levure sur un extrait de levure peptone dextrose, ou une plaque de gélose YPD. Laissez-les pousser pendant 48 heures à 30 degrés Celsius pour obtenir des colonies uniques.

Après l’incubation, inoculer les colonies individuelles de la plaque YPD et cinq millilitres de milieu YPD, et incuber à 30 degrés Celsius pendant 48 heures en agitant 250 tr / min. Les cellules sont dans la phase stationnaire de croissance après cette période d’incubation. Sur une nouvelle plaque YPD, dessinez la grille d’efficacité d’accouplement sous la forme d’un rectangle de 1 centimètre sur 1,5 centimètre divisé en trois boîtes, chacune d’une dimension de 1 centimètre sur 0,5 centimètre.

Inoculer cinq microlitres de la culture YPD des deux types d’accouplement sur les rectangles les plus à gauche et à droite. Ce volume correspond à environ 5 fois 10 à la cinquième cellule haploïde dans chaque section. Incuber les plaques pendant 24 heures à 30 degrés Celsius.

Pour mélanger un nombre égal de cellules de levure, retirez environ 1/3 de la croissance de levure développée dans les boîtes extérieures à l’aide d’un cure-dent stérile et remettez en suspension les cellules retirées dans 20 microlitres d’eau dans un flacon stérile de 1,5 millilitre. Suivez ceci pour chaque haploïde. Ensuite, diluez cinq microlitres de cette suspension dans deux millilitres d’eau et mesurez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nanomètres.

En fonction de la valeur de densité optique et du nombre de cellules par millilitre à une densité optique, ajoutez les volumes requis des deux haploïdes dans un flacon frais et stérile de 1,5 millilitre. Bien mélanger à l’aide d’une pipette. Le volume final de cette suspension est généralement d’environ six à huit microlitres.

Ensuite, inoculez cette suspension dans la grille centrale. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant sept heures, permettant aux haploïdes de s’accoupler. Après sept heures d’incubation, grattez les cellules du rectangle central à l’aide d’un cure-dent ou d’un embout de pipette et diluez dans deux millilitres d’eau stérile.

Effectuer d’autres dilutions, puis étaler la suspension cellulaire sur gélose YPD pour obtenir des colonies uniques. Après le placage, incuber les plaques YPD à 30 degrés Celsius pendant 36 à 48 heures pour développer des colonies uniques. S’assurer que quelques centaines de colonies individuelles sont obtenues à partir de chaque expérience d’accouplement pour le dépistage afin d’assurer la signification statistique des données.

Pour identifier les colonies diploïdes sur la plaque, transférer les colonies simples en les striant individuellement sur une double plaque de goutte, dépourvue des acides aminés pour lesquels les souches sont auxotrophes. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures et calculer l’efficacité d’accouplement, nu. La robustesse du protocole a permis de différencier facilement l’efficacité d’accouplement entre les deux souches, SK1AM et ScAM.

Alors que les souches SK1 se sont accouplées avec un rendement très élevé, les souches ScAM se sont accouplées avec une efficacité relativement inférieure. L’efficacité d’accouplement des souches ScAM a chuté de manière significative lorsque l’environnement ne contenait pas de glucose comme source primaire de carbone, ce qui indique que l’accouplement est un processus coûteux sur le plan énergétique et que la croissance sur d’autres sources de carbone réduit qualitativement l’efficacité de l’accouplement. Lorsqu’on a permis de s’accoupler pendant différentes périodes, aucun accouplement n’a été observé pendant les quatre à cinq premières heures.

Les premiers diploïdes ne sont apparus qu’après quatre à cinq heures, ce qui indique que c’est le temps nécessaire pour que le processus d’accouplement soit terminé dans l’environnement donné. Après cela, l’efficacité de l’accouplement a augmenté rapidement. Au-delà de sept heures, les calculs d’efficacité d’accouplement ont été influencés par le fait que la croissance mitotique a commencé dans la plaque.

Assurez-vous qu’un nombre égal des deux haploïdes sont mélangés. Des écarts par rapport à cette règle entraîneraient des variations dans les répétitions indépendantes du protocole. L’impact du flux génétique sur l’adaptation et la spéciation est une question ouverte.

Étant donné que les marqueurs auxotrophes sont insérés à côté du locus MAT dans nos souches, cela aide à répondre à cette question importante.