Évaluation des activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées in vitro

Les protocoles fournissent une méthode pour examiner les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées, des études préliminaires aux examens de surface plus complexes. Contrairement aux méthodes décrites précédemment qui ont abouti à des données incomparables d’une étude à l’autre, ces méthodes produisent des résultats cohérents et comparables sur différents matériaux nanoparticulaires, matériaux nanostructurés et espèces microbiennes. Il peut être difficile de maintenir une distribution homogène des nanoparticules dans les méthodes A et B.

Le tourbillonnage complet des échantillons assurera la suspension de nanoparticules, et le pipetage trois à quatre fois entre les aliquotes maintiendra les suspensions Commencez à collecter les bactéries cultivées en aliquoteant un millilitre de la culture bactérienne cultivée pendant la nuit dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre. Après avoir créé un nombre suffisant d’aliquotes, centrifugez-les pour atteindre la densité de sièges souhaitée. Rassembler le surnageant dans un récipient de collecte.

Et re-suspendre la pastille de cellule dans 0,5 millilitre de milieu de croissance frais. Combinez la suspension de deux tubes et répétez la centrifugalisation. Après centrifugation, donner un deuxième lavage avec un milieu de croissance frais et répéter la combinaison du contenu de deux tubes en un seul avant de centrifuger les tubes.

Donner le troisième lavage avec 0,33 millilitre de tampon tris ou tampon hydroxyéthylaminométhane. Combinez les trois suspensions, chacune d’un volume de 0,33 millilitre, en une microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Après centrifugation, retirez le surnageant des cellules granulées et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon tris frais qui sera connu sous le nom de suspension cellulaire ou de culture d’ensemencement bactérien en phase de retard.

Pour former les cultures de bactéries et de nanoparticules, aliquote les deux millilitres de la culture d’ensemencement bactérien dans chaque puits d’une plaque de polystyrène non tissulaire traitée à 12 puits. Pour chaque tube microcentrifuge de cinq millilitres contenant des particules d’oxyde de magnésium prépesées, ajouter trois millilitres de culture d’ensemencement bactérien. Et vortex brièvement le tube pour mélanger les nanoparticules d’oxyde de magnésium avec les bactéries.

Après mélange, aliquote un millilitre de nanoparticules d’oxyde de magnésium en suspension dans trois puits distincts pour créer les échantillons triplicates de chaque poids prémesuré de nanoparticules d’oxyde de magnésium. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 120 rpm. Et transférez un échantillon de trois millilitres dans un tube conique individuel de 15 millilitres à l’aide d’une pipette.

Effectuez ensuite une à 10 dilutions en série dans une plaque de 96 puits en ajoutant 180 microlitres de tampon tris à chaque puits de la rangée B à la rangée G pour le nombre approprié de colonnes. Vortex brièvement un tube conique de 15 millilitres contenant des échantillons bactériens et ajouter 50 microlitres d’échantillon bactérien à un puits individuel de la rangée A.Ensuite, à partir de la rangée A, transférer 20 microlitres d’échantillon bactérien dans le puits correspondant de la rangée B avec un bref mélange. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, transférer 20 microlitres du puits de la rangée B au puits correspondant de la rangée C.Continuez jusqu’à la rangée G pour terminer la dilution en série de 10 à la dilution négative de la rangée B à la dilution négative de la rangée B à la dilution négative de six de la rangée G.Une fois terminé, pipeter 100 microlitres de chaque puits dans une plaque de gélose de croissance appropriée, et répartis sur la plaque pour disperser la culture cellulaire.

Placez les plaques de puits dans un agitateur d’incubateur pendant la nuit à 37 degrés Celsius et incuber les plaques de gélose à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Examinez la plaque et comptez les plaques ayant environ 25 à 300 colonies. Si possible, choisir des plaques ayant la même valeur de dilution.

Pour chaque matériau à tester, diluer les échantillons bactériens pendant la nuit en ajoutant trois aliquotes de 200 microlitres au milieu de croissance dans trois puits, et trois aliquotes de 200 microlitres de la culture bactérienne dans des puits supplémentaires. Placez la plaque de 96 puits dans le lecteur de plaques et scannez-la. Si nécessaire, continuez à ajouter du bouillon ou une culture bactérienne pendant la nuit jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres, ou OD 600, soit atteinte d’environ 0,01.

Pour préparer des suspensions de nanoparticules bactériennes et des suspensions de nanoparticules de milieux stériles, retirez un millilitre de culture bactérienne ou de milieu d’un ensemble triple de tubes coniques de 15 millilitres. Et ajoutez-le dans un tube à centrifuger de cinq millilitres contenant des nanoparticules prémesurées. Vortex les tubes pour mélanger la solution.

Répartir les nanoparticules de manière homogène en transférant des aliquotes d’un millilitre du tube centrifuge de cinq millilitres au tube conique de 15 millilitres. Une fois cela fait, aliquote 200 microlitres de chaque échantillon dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits. Après avoir déterminé la densité de sièges décrite précédemment, ajouter les échantillons et le contrôle dans les puits individuels d’une plaque de polystyrène non tissulaire de 48 puits.

Ensuite, aliquote les 0,75 millilitres de la suspension cellulaire dans chaque puits contenant les échantillons et les témoins. Placez la plaque de 48 puits dans un agitateur d’incubateur pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, avec agitation à 120 tr / min. Après l’incubation, prélever deux échantillons de chaque groupe et les transférer individuellement dans des tubes microcentrifugés de cinq millilitres étiquetés.

Ajouter deux millilitres de fluide corporel simulé révisé, ou RSBF, à chaque tube. Préparez des papiers de protoxysme cellulosique stérilisés en les coupant en un centimètre de diamètre. Placer le papier de nitrocellulose coupé sur une plaque de gélose contenant le milieu approprié.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de culture bactérienne diluée sur le papier filtre avant d’ajouter 50 microlitres d’un milieu approprié au centre de chaque surface d’échantillon. À l’aide d’une pince à épiler stérilisée, ramassez le papier cellose nitrique de la surface de la tarière. Retournez soigneusement le papier de cellulose nitrique et placez-le sur la surface de l’échantillon afin que les bactéries soient en contact avec les 50 microlitres de milieu et la surface nanostructurée d’intérêt.

Si l’échantillon est dégradable en culture, placez un support en dessous pour le soulever afin d’éviter tout contact avec le tampon tris. Maintenez l’humidité en ajoutant un millilitre de tampon tris à un échantillon contenant un puits. Après une nuit d’incubation, prélever le papier de nitrocellulose de chaque surface d’échantillon et le placer dans cinq millilitres de tampon tris.

Vortex les papiers filtres collectés et les échantillons de matériaux nanosurface pendant cinq secondes. Prélever les suspensions tampons tris de l’échantillon et les placer dans des tubes de collecte frais individuels. Les effets antimicrobiens à l’aide de la méthode A ont permis d’identifier une concentration minimale et inhibitrice, ou CMI, d’un milligramme par millilitre de nanoparticules d’oxyde de magnésium et des concentrations bactéricides minimales, ou MBC 99,9, de 1,0 et 1,6 milligramme par millilitre de nanoparticules d’oxyde de magnésium pour Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif respectivement.

L’épiderme de staphylocoque à Gram positif, S.Aureus, et le staphylocoque doré résistant à la méthicilline, ou SARM, ont démontré les valeurs du CMI de 0,5, 0,7 et un milligramme par millilitre de nanoparticules d’oxyde de magnésium respectivement. NBC 99.99 valeurs de 1,6 et 1,2 milligramme par millilitre ont été identifiées pour S. epidermis et S. aureus respectivement. Alors que le SARM n’a pas été réduit au-delà de NBC 90.

Des CMI de 1,2 et un milligramme par millilitre ont été identifiées chez les espèces de candida sensibles aux médicaments et résistantes aux médicaments, C albicans et C albicans résistantes au fluconazole, ou FR respectivement. En revanche, les nanoparticules d’oxyde de magnésium ont démontré des valeurs de CMI de un et 0,7 milligramme par millilitre, ou C. glabrata et C glabrata résistant à l’échinocandine, ou ER respectivement. Chaque espèce candidate a atteint un NBC 90 de 0,7 à 1,2 milligramme par millilitre, mais seul C. glabrata ER a été réduit à NBC 99,9 à 1,2 milligramme par millilitre.

Dans la méthode B, le SARM exposé aux nanoparticules a augmenté de façon exponentielle pour atteindre une DO de 0,85. L’exposition à 1,2 milligramme par millilitre de nanoparticules d’oxyde de magnésium et à 6,25 milligrammes par millilitre de triméthoprime a entraîné une réduction de 80,2% et 81,6% de la croissance bactérienne respectivement. De même, 2,9 milligrammes par millilitre de nanoparticules d’hydroxyde de magnésium ont réduit la croissance bactérienne à 70,3%L’exposition à un microlitre par millilitre de vancomycine a entraîné une réduction de 99,99% de la croissance du SARM, suggérant l’activité bactériostatique des nanoparticules d’oxyde de magnésium et d’hydroxyde de magnésium.

La méthode C n’a montré aucune inhibition de la croissance bactérienne par contact indirect. Les résultats ont indiqué que ZC21 avait la plus forte activité antibactérienne contre l’adhésion et la croissance du SARM, pour tous les échantillons testés. Dans la méthode D, aucun staphylocoque doré viable n’a été identifié dans les échantillons 1.9A, 1.9 AA et EPD, ou leurs papiers filtres appariés.

Cependant, l’exposition aux échantillons EPD après un agenouillement a réduit la croissance bactérienne à quelques cellules sur la surface nanostructurée et le papier filtre épuré. L’identification des activités antimicrobiennes de surface nanoparticulaires et nanostructurées a conduit à des recherches supplémentaires dans les applications de bio-ingénierie, y compris celles liées aux plaies chroniques et aux infections liées aux implants.