Immunofluorescence multiplex combinée à l’analyse d’images spatiales pour l’évaluation clinique et biologique du microenvironnement tumoral
2 juin 2023
Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence multiplex (mIF) manuelle d’amplification du signal tyramide (TSA) combiné à l’analyse d’images et à l’analyse spatiale est décrit. Ce protocole peut être utilisé avec des coupes de paraffine fixées au formol (FFPE) pour la coloration de deux à six antigènes par lame selon le scanner de lames disponible en laboratoire.
Dans notre laboratoire, nous étudions le cancer colorectal humain. Sa progression vers la maladie métastatique et sa réponse au traitement, y compris l’immunothérapie. Nous essayons de trouver de nouveaux biomarqueurs prédictifs et pronostiques en étudiant le microenvironnement immunitaire tumoral et le microbiome intratumoral dans les maladies primaires et métastatiques.
Dans notre projet, nous mettons actuellement en œuvre plusieurs technologies telles que le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’exome entier, l’analyse de l’ADN acellulaire circulant par séquençage, l’immunofluorescence et l’hybridation de l’institut de fluorescence. À l’heure actuelle, notre défi majeur est de combiner la coloration par hybridation de l’institut de fluorescence avec l’immunofluorescence multiplex d’amplification du signal tyramide pour étudier l’interaction entre le microbiome et les cellules immunitaires. Notre méthode est robuste, reproductible, facile à utiliser et rentable.
Il peut être installé dans n’importe quel laboratoire possédant un scanner à lumière fluorescente et la méthode peut être utilisée avec n’importe quel anticorps IHC disponible dans le commerce par opposition aux kits disponibles dans le commerce qui sont généralement optimisés pour un panel restreint d’antigènes.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'amplification manuelle du signal par tyramide (TSA) en immunofluorescence multiplexe (mIF) combinée à une analyse d'image et spatiale. La méthode s'applique à des sections fixées au formol et incluses dans la paraffine (FFPE) pour la coloration de plusieurs antigènes par lame.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Pathologie
Contexte
- Étude du cancer colorectal humain et de sa progression.
- Accent mis sur le microenvironnement immunitaire tumoral et le microbiome intratumoral.
- Utilisation de diverses technologies, notamment le séquençage ARN et l'immunofluorescence.
- Difficultés liées à la combinaison de différentes méthodes de coloration pour une analyse complète.
Objectif de l'étude
- Trouver de nouveaux biomarqueurs prédictifs et pronostiques.
- Étudier l'interaction entre le microbiome et les cellules immunitaires.
- Développer une méthode de coloration robuste et reproductible.
Méthodes utilisées
- Amplification manuelle du signal par tyramide en immunofluorescence multiplex.
- Analyse d'images à l'aide d'algorithmes de fluorescence à haut degré de multiplexage.
- Hybridation in situ en fluorescence combinée à l'immunofluorescence.
- Protocole de coloration détaillé pour des coupes de tissus FFPE.
Résultats principaux
- Coloration réussie de plusieurs antigènes sur une seule lame.
- Optimisation de la spécificité des anticorps et du rapport signal sur bruit.
- Analyse d'image efficace produisant des données quantifiables.
- Démonstration de l'applicabilité de la méthode dans divers laboratoires.
Conclusions
- La méthode TSA mIF est polyvalente et rentable.
- Elle peut être adaptée à divers anticorps et antigènes.
- Cette approche améliore la compréhension de la biologie tumorale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'immunofluorescence multiplexe (mIF) associée à une analyse d'image spatiale permet une cartographie quantitative à haut contenu du microenvironnement tumoral (TME), soutenant ainsi la découverte de biomarqueurs et la réduction des risques mécanistiques dans les pipelines en oncologie. Ce flux de travail fournit des informations exploitables sur les interactions entre les cellules immunitaires et stromales, orientant les stratégies de biomarqueurs prédictifs et la recherche translationnelle. Sa reproductibilité et sa compatibilité avec divers anticorps en font une capacité évolutible pour la recherche et le développement en oncologie à l'échelle industrielle.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation avec résolution spatiale des interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales pour la validation de cibles.
- Contribue à l'analyse mécanistique et à la réduction des risques en quantifiant les densités cellulaires et les proximités entre types cellulaires au sein des compartiments tumoraux.
- Facilite l'identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs et pronostiques pour le tri des projets.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes tissulaires validés pour le criblage multiplexé de biomarqueurs en aval.
- Fournit des données spatiales standardisées, reproductibles et quantitatives pour le développement d'analyses.
- Permet une évaluation rigoureuse de la spécificité des anticorps et de l'optimisation du rapport signal/bruit en vue du criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Assure l'alignement de l'analyse spatiale des biomarqueurs avec des modèles pertinents pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque en reliant les caractéristiques du microenvironnement tumoral (TME) à des hypothèses de réponse thérapeutique.
- Fournit des résultats quantitatifs destinés à des comparaisons inter-études et inter-cohortes dans la recherche préclinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce flux de travail d’IFm et d’analyse spatiale relie la découverte précoce, la validation de biomarqueurs et la recherche translationnelle dans les portefeuilles d’oncologie.
- Biologie de la découverte : Quantifie les distributions des cellules immunitaires et stromales afin d'élucider les mécanismes induits par le microenvironnement tumoral.
- Depistage : Standardise les tests tissulaires multiplexés pour obtenir des résultats reproductibles et quantitatifs.
- Analytique : Exporte les données spatiales et de densité pour permettre la comparaison statistique des compartiments tumoraux et des interactions cellulaires.
- Recherche translationnelle : Associe les profils spatiaux des biomarqueurs à la réponse thérapeutique, soutenant ainsi la continuité entre les phases préclinique et clinique.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à tout panel d'anticorps et à tout type de tumeur, permettant une application étendue à l'ensemble du portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans le choix des biomarqueurs et des cibles en précisant les interactions cellulaires spatiales.
- Valeur opérationnelle : Offre une analyse tissulaire multiplexée reproductible, évolutive et rentable.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et réduit les risques biologiques en phase avancée grâce à une caractérisation robuste du microenvironnement tumoral (TME).
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des actifs en oncologie ajustée au risque, fondée sur des preuves de biomarqueurs spatiaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunofluorescence, en analyse d'images et en traitement statistique des données.
- Suppose l'accès à un scanner de lames fluorescent et à un logiciel d'analyse d'images compatible.
- Exige une standardisation interéquipes de la validation des anticorps et des protocoles de coloration.
- Peut être adapté à différents types de tumeurs et panels d'anticorps moyennant une optimisation appropriée.
- Dépend d'une spécificité rigoureuse des anticorps et d'une optimisation du rapport signal/bruit pour des résultats fiables.
