Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome
13 octobre 2023
Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.
Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs se développent et que nous nous intéressons à la compréhension des subtilités de la façon dont les cellules interagissent au sein de la tumeur et influencent les résultats des patients, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté. Le séquençage multiome, qui permet l’acquisition d’ARN d’une seule cellule et le séquençage d’attaque à partir de la même cellule de manière appariée, constitue une avancée significative vers cette fin. Cependant, la qualité des données obtenues à partir de ces expériences dépend fortement de la qualité des conditions expérimentales et du matériel biologique introduit.
Ce protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plateforme 10x Genomics. Ce protocole est fiable en utilisant des suspensions unicellulaires fraîches ou congelées. Nous fournissons des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions de cellules uniques et l’évaluation des noyaux isolés.
Dans ce protocole, nous avons utilisé des échantillons d’adénocarcinome canalaire pancréatique humain, qui sont un type de tissu principal dans notre laboratoire. Le cancer du pancréas représente un type de tumeur hautement desmoplastique, ce qui laisse présager des tissus relativement collants ainsi que des cellules. De plus, comme les échantillons de tumeurs pancréatiques disponibles pour la recherche ont également tendance à être relativement petits, des efforts sont faits pour maximiser la quantité de cellules capturées.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode fiable et optimisée pour isoler des noyaux à partir d'échantillons de tumeurs solides en vue d'un séquençage multi-omique à l'aide de la plateforme 10x Genomics. Il inclut des recommandations concernant les conditions de dissociation des tissus et la cryoconservation des suspensions monocellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Génomique
Contexte
- Comprendre la biologie tumorale est essentiel pour améliorer les résultats chez les patients.
- L'analyse des cellules hétérogènes présentes dans le microenvironnement tumoral revêt une importance croissante.
- Le séquençage multi-omique permet l'acquisition appariée de séquençages ARN unicellulaire et ATAC unicellulaire.
- La qualité des données dépend fortement des conditions expérimentales et du matériel biologique.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole fiable pour l'isolement de noyaux à partir de tumeurs solides.
- Améliorer la qualité des données de séquençage multi-omiques.
- Faciliter l'analyse des microenvironnements tumoraux.
Méthodes utilisées
- Isolation de noyaux à partir d'échantillons de tumeurs solides.
- Utilisation de suspensions monocellulaires fraîches ou congelées.
- Recommandations concernant les conditions de dissociation des tissus.
- Techniques de cryoconservation pour les suspensions monocellulaires.
Résultats principaux
- Une approche optimisée pour l'isolement des noyaux a été établie.
- Des résultats fiables obtenus à partir d'échantillons frais et congelés.
- Qualité améliorée des données pour le séquençage multi-omique.
- Des lignes directrices pour le traitement des tissus et la cryoconservation ont été fournies.
Conclusions
- Le protocole améliore la fiabilité de l'isolement des noyaux à partir de tumeurs.
- Il soutient le développement de techniques de séquençage multi-omiques.
- Les études futures peuvent bénéficier de conditions expérimentales améliorées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
L'isolement optimisé des noyaux à partir d'échantillons de tumeurs solides est essentiel pour générer des données de séquençage multiomiques de haute qualité, influant directement sur la fiabilité des analyses de l'hétérogénéité tumorale en oncologie translationnelle. Ce protocole répond au défi de l'extraction de noyaux intacts à partir de tissus tumoraux désmoplastiques frais et congelés, permettant un profilage multiomique robuste à l'échelle cellulaire unique. Une préparation fiable des noyaux à ce stade améliore la confiance prédictive dans les pipelines de découverte en aval et de développement de biomarqueurs.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une analyse de haute fidélité de l'hétérogénéité des cellules tumorales au niveau monocellulaire.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en préservant les populations cellulaires diverses durant l'isolement.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à une représentation précise du microenvironnement tumoral.
Développement de tests et criblage
- Permet des préparations standardisées de noyaux pour des essais de séquençage multiomique reproductibles.
- Assure une cohérence quantitative et qualitative du matériel d'entrée pour les flux de travail en aval.
- Améliore la préparation des essais en permettant l'utilisation d'échantillons tumoraux frais ou cryoconservés.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur la découverte de biomarqueurs translationnels en permettant un profilage apparié de l'ARN et de l'accessibilité de la chromatine.
- Conserve la pertinence pathologique en capturant la complexité des microenvironnements tumoraux solides.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en standardisant la qualité des échantillons d'entrée.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement de noyaux s'inscrit à l'interface du traitement des tissus et de la génération de données multiomiques, faisant le lien entre les flux de travail de découverte précoce et de recherche translationnelle.
- Découverte en biologie : Maximise la puissance des tests d'hypothèses en préservant la diversité et l'intégrité cellulaires.
- Tri : Fournit des noyaux reproductibles et de haute qualité pour des tests de séquençage multiomique évolutifs.
- Analyse : Permet des lectures quantitatives robustes pour comparer les états des cellules tumorales et les paysages de chromatine.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs en permettant des analyses appariées de RNA unicellulaire et de séquençage ATAC.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole standardisé et adaptable pour divers types de tumeurs solides et conditions d'échantillonnage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études sur la biologie tumorale et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la reproductibilité à l’échelle de prélèvements tumoraux frais et congelés.
- Valeur stratégique : Réduit le risque de perte de données ou d’introduction d’artéfacts lors de l’étape de préparation des échantillons.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l’avancement ajusté au risque des programmes de découverte en oncologie et des programmes translationnels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissociation des tissus et en manipulation des noyaux pour obtenir un rendement et une qualité optimaux.
- Exige un accès à des réactifs spécialisés, des filtres à cellules et des outils d'évaluation quantitative.
- Implique une standardisation inter-équipes des conditions de digestion et de lyse afin d'assurer la reproductibilité.
- Doit être adapté aux différents types de tumeurs et aux tailles d'échantillons variables, en particulier pour les tissus désmoplastiques.
- Un suivi attentif de l'intégrité nucléaire est essentiel pour éviter les artefacts en séquençage en aval.
