Surveillance actine démontage Time-lapse microscopie
8 novembre 2006
Très bien, ce que je souhaite faire aujourd'hui est de vous montrer comment construire une chambre d'écoulement, une chambre de fusion pour l'imagerie sur un microscope droit. Ensuite, je crée deux espaces à l'aide d'un film. Pour cela, je prends du film parafiné, que je découpe en petites bandes.
Ensuite, je vais procéder à la formation des canaux pour les parois, puis je les sèche avec un flux d'air incliné. Je place la lame couvre-objet sur le dessus du para, et voici le produit fini. Puis, je chauffe l'ensemble sur un bloc chauffant afin de faire fondre le para et créer essentiellement une étanchéité.
Ce que nous avons ici, c'est le verre de couverture, puis au-dessus du verre de couverture se trouvent deux couches de PhIM, comme vous pouvez le voir ici. Et par-dessus cela, il y a à nouveau un lamelle de 22 par 22 millimètres. Celui-ci, que j'ai appuyé contre le param pour former le scellement.
Très bien, le liquide pénètre dans un sens ici, et je peux l'aspirer à l'aide d'un papier filtre dans ce sens. Je vais vous montrer comment procéder un peu plus tard. Ce que j'aime faire, c'est le placer dans une enceinte humidifiée, ce qui est très simple.
Prenez deux types de bandes surélevées et placez un filtre en papier en dessous. Pour maintenir une certaine turbulence pendant que je travaille, je mets le couvercle, la lamelle, sur la chambre d'écoulement. Pour introduire une solution dans la chambre, il suffit de placer la pointe de pipette à l'entrée de la chambre et de déposer délicatement le liquide.
Maintenant, ce que je fais, c'est que j'incube la chambre avec le couvercle fermé pendant 10 minutes. Ce que je fais habituellement pour aspirer le liquide de l'autre côté consiste à utiliser du papier filtre que je découpe en fines bandes comme celle-ci. Je prends alors une de ces bandes fines et j'applique simultanément la solution à l'entrée tout en plaçant le papier filtre à la sortie pour aspirer le milieu, la solution.
Vous verrez donc le liquide circuler dans la solution. Ensuite, j'attends cinq minutes pour la fermeture intermédiaire. Maintenant que je suis prêt, je dois effectivement introduire l'actine, que je dois polymériser ; je réalise cette polymérisation à l'intérieur de la chambre d'écoulement, selon exactement les mêmes procédures qu'auparavant.
Donc, comme ceci, et maintenant que l’action est polymérisée, je lave tout l’excès d’action non polymérisée à l’aide d’un grand volume de tampon. Ici, j’ai environ cent microlitres, ce qui correspond à plusieurs volumes de la chambre de réaction de tampon. Simplement, vous savez, lorsque le papier filtre est saturé, je dois changer de direction. D’accord ?
Et donc je suis prêt à effectuer l'imagerie avec ceci. Ainsi, la chambre de perfusion avec l'actine qui y est attachée. Maintenant, je prends la lame, je la monte sous le microscope, et comme j'effectue l'imagerie avec un objectif à immersion huileuse, je vais déposer un peu d'huile d'immersion sur la surface supérieure du coverslip, en veillant à ce que celle-ci entre en contact avec la solution, la protéine ou tout autre élément présent sur l'actine à l'intérieur.
Ce que je fais, c'est que je peux effectivement changer la solution pendant que j'effectue l'imagerie en laps de temps. Ainsi.
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Aperçu
Cet article décrit la construction d'une chambre d'écoulement et d'une chambre de fusion pour l'imagerie sur un microscope droit. Le processus implique la création de canaux à l'aide de parafilm et leur scellement par chauffage.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
Contexte
- Les chambres d'écoulement sont essentielles pour diverses techniques d'imagerie.
- La construction d'une chambre de fusion permet d'améliorer les capacités d'imagerie.
- Le Parafilm est couramment utilisé en laboratoire pour créer des joints étanches.
- Comprendre le processus de construction est crucial pour les chercheurs dans ce domaine.
Objectif de l'étude
- Fournir un guide étape par étape pour la construction d'une chambre d'écoulement.
- Illustrer l'utilisation du parafilm pour créer des chambres d'imagerie.
- Améliorer l'accessibilité des techniques d'imagerie pour les chercheurs.
Méthodes utilisées
- Découper le parafilm en bandes pour former des canaux.
- Sécher les bandes avec un courant d'air incliné.
- Placer une lame de couverture sur le parafilm.
- Chauffer l'ensemble sur un bloc chauffant pour créer un joint étanche.
Résultats principaux
- Une chambre d'écoulement fonctionnelle a été construite avec succès.
- Le processus d'étanchéification s'est révélé efficace pour créer un environnement stable pour l'imagerie.
- La méthode décrite est reproductible pour une utilisation en laboratoire.
- Les chercheurs peuvent utiliser cette technique pour diverses applications d'imagerie.
Conclusions
- La construction des chambres d'écoulement et de fusion est simple.
- Cette méthode peut faciliter des études d'imagerie avancées.
- Un accès accru à ces techniques peut améliorer les résultats de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet la préparation reproductible de microenvironnements contrôlés pour l'imagerie de cellules vivantes, facilitant ainsi les études mécanistiques des dynamiques du cytosquelette. En standardisant l'assemblage de la chambre d'écoulement, il réduit la variabilité des tests basés sur la perfusion, améliorant la cohérence des données entre les équipes de recherche. La méthode facilite l'analyse quantitative de la cinétique de désassemblage de l'actine, un processus clé dans la motilité cellulaire et la transduction du signal, pertinent pour la validation de cibles en oncologie et en immunologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'observation directe de la dynamique de dépolymérisation de l'actine afin d'étudier les régulateurs du remaniement du cytosquelette.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme normalisée pour tester les effets de composés sur le renouvellement de l'actine dans des cellules vivantes.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Permet le développement de lectures basées sur la fluorescence des taux de désassemblage de l'actine comme critère d'évaluation fonctionnel.
- Valeur opérationnelle : Permet l'échange de solution pendant l'acquisition d'images en laps de temps pour évaluer les relations dose-réponse sous perfusion.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre la dynamique de l'actine et les phénotypes cellulaires associés à la métastase, à l'invasion et à la formation de la synapse immunitaire.
- Valeur opérationnelle : Permet l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de voies biologiques à l'aide de biomarqueurs d'imagerie quantifiables.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage de l'interaction avec la cible à la validation fonctionnelle dans des systèmes cellulaires pertinents pour la maladie.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les régulateurs du cytosquelette grâce à la visualisation en temps réel du flux d'actine.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives et reproductibles de la désassemblage de l'actine dans des conditions de perfusion contrôlées.
- Analytique : Génère des données de fluorescence résolues temporellement, permettant la modélisation cinétique du renouvellement de l'actine.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre le mécanisme moléculaire et les phénotypes cellulaires dans des modèles précliniques de migration cellulaire.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme de perfusion réutilisable, adaptable à plusieurs cibles cytosquelettiques et types cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduction des risques mécanistiques associés aux cibles impliquées dans la régulation de l’actine grâce à des lectures fonctionnelles directes.
- Valeur opérationnelle : Une préparation standardisée des chambres améliore la reproductibilité du test entre différents sites et opérateurs.
- Valeur stratégique : Permet de prendre plus tôt des décisions d’avancement ou d’abandon en reliant la modulation de la cible à des effets fonctionnels sur le cytosquelette.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des composés ajustée au risque en fonction de leurs effets sur les phénotypes de motilité et d’envahissement cellulaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes et en contrôle de flux microfluidique.
- Suppose l'accès à des microscopes droits équipés de contrôle environnemental et de capacités de perfusion.
- Exige une standardisation de l'épaisseur du parafilm et des paramètres de scellement pour assurer une cohérence entre les chambres.
- L'adaptation à différents types cellulaires peut nécessiter une optimisation des conditions d'enduction de surface et de polymérisation de l'actine.
- Les limites pratiques incluent les effets potentiels des contraintes de cisaillement sur les cellules lors de perfusions prolongées, comme indiqué dans le protocole.
