Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution
10 novembre 2023
L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.
Un défi courant dans la préparation d’échantillons de cryo-microscopie électronique est la localisation des particules à l’interface air-eau, ce qui fait que les particules adoptent des orientations préférées et se dénaturent. Au lieu de cela, il est préférable de faire reposer les particules sur la surface de la grille, que le film mince soutient, comme le graphène. Un autre défi est l’exigence de concentrations d’échantillons relativement élevées, qui pourraient également être résolues par le graphène.
Les grilles revêtues de graphène offrent de nombreux avantages pour la détermination de la structure cryoEM, mais ont toujours été difficiles à fabriquer en interne de manière reproductible, ainsi que leur coût d’achat prohibitif dans le commerce. Ce protocole permet le dépôt robuste de graphène monocouche, réduisant ainsi la barrière à l’utilisation de ces grilles par les utilisateurs dans leurs recherches. Le graphène est unique en raison de ses propriétés matérielles.
Il s’agit d’une monocouche de carbone et présente donc un bruit de fond minimal. D’autres supports de grille cryoEM, tels qu’une fine couche de carbone amorphe ou de flocons d’oxyde de graphène, ne peuvent pas être appliqués en monocouche unique et contribuent à un signal de fond plus important. Maintenant que nous avons établi un protocole robuste pour l’application du graphène aux grilles cryoEM, nous aimerions poursuivre la fonctionnalisation de grilles recouvertes de graphène avec des poignées d’affinité pour la capture sur grille directement à partir de lysats cellulaires.
Cela pourrait atténuer un autre goulot d’étranglement dans la préparation des échantillons cryoEM.
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Aperçu
Cet article présente un protocole pour recouvrir des grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) d'une monocouche de graphène. L'utilisation du graphène augmente la densité de particules, minimise les interactions avec l'interface air-eau et améliore la distribution de l'orientation des particules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie électronique cryogénique
- Science des matériaux
- Techniques de préparation des échantillons
Contexte
- La localisation des particules à l'interface air-eau est un défi courant en microscopie électronique cryogénique.
- Les orientations préférentielles peuvent entraîner la dénaturation des particules.
- Les supports en graphène peuvent aider les particules à se déposer à la surface de la grille.
- Historiquement, la fabrication des grilles recouvertes de graphène a été difficile et coûteuse.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole robuste pour le dépôt de graphène en monocouche sur des grilles de cryoME.
- Réduire les obstacles empêchant les chercheurs d'utiliser des grilles recouvertes de graphène.
- Améliorer les avantages de la détermination des structures par cryo-microscopie électronique.
Méthodes utilisées
- Développement d'un protocole de revêtement au graphène.
- Évaluation de la densité des particules et de leur orientation.
- Comparaison des grilles revêtues de graphène avec les grilles traditionnelles.
- Évaluation de la reproductibilité dans la fabrication des grilles.
Résultats principaux
- Les grilles revêtues de graphène améliorent considérablement la localisation des particules.
- Une densité accrue de particules permet une meilleure détermination de la structure.
- Un protocole robuste facilite la fabrication interne de grilles en graphène.
- Des coûts réduits et un accès amélioré pour les chercheurs.
Conclusions
- L'utilisation de graphène dans les grilles de cryo-ME résout des défis clés liés à la préparation des échantillons.
- Ce protocole permet une adoption plus large des grilles recouvertes de graphène dans la recherche.
- Les propriétés uniques du graphène améliorent les capacités de la cryo-ME.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
Les goulots d'étranglement liés à la préparation des échantillons en microscopie électronique cryogénique (cryoEM) limitent le débit et la fiabilité de la détermination de structures à haute résolution dans les phases précoces de la découverte et des pipelines en biologie structurale. L'application de graphène monocouche aux grilles de cryoEM résout des problèmes critiques liés à la localisation des particules, au biais d'orientation et aux exigences de concentration des échantillons, influant directement sur la confiance prédictive dans les études de validation ciblée et les mécanismes moléculaires. Des protocoles robustes et reproductibles pour les grilles de graphène permettent une adoption plus large en milieu industriel, soutenant l'avancement de portefeuilles ajusté au risque et une allocation efficace des ressources.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une analyse structurale fidèle des cibles macromoléculaires avec une résolution proche de l'échelle atomique.
- Réduit la dénaturation de l'échantillon et les biais d'orientation, facilitant ainsi la réduction des risques mécanistiques.
- Permet une validation fiable de la cible en améliorant la densité des particules et la cohérence des images.
Développement de tests et criblage
- Prépare des supports de grille standardisés et reproductibles pour les flux de travail cryoME en aval.
- Améliore la fiabilité des tests en minimisant le bruit de fond et en améliorant les résultats quantitatifs de l'imagerie.
- Permet le criblage à grande échelle de complexes structurellement divers à de plus faibles concentrations d'échantillon.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet des études structurales de complexes pertinents pour les maladies, soutenant l'alignement translationnel des biomarqueurs.
- Assure la continuité entre l'élucidation structurale en phase de découverte et la validation préclinique des mécanismes moléculaires.
- Réduit le risque d'échec biologique en phase avancée en garantissant la qualité des données structurales.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La préparation de la grille en graphène monocouche s'intègre dans le flux de travail de cryoME, depuis la découverte initiale jusqu'à l'identification des candidats et la recherche préclinique, en soutenant la détermination des structures guidée par des hypothèses et l'acquisition de connaissances mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Permet des comparaisons structurelles précises entre différentes conditions, facilitant ainsi des tests d'hypothèses nulles rigoureux.
- Écrans de sélection : Fournit des grilles reproductibles à faible bruit de fond pour l'imagerie quantitative et la normalisation des tests.
- Analytique : Offre des figures de diffraction et des cartes de densité de haute qualité destinées à l'analyse statistique et à l'aide à la décision.
- Recherche translationnelle : Préserve la continuité des données structurales pour les cibles et complexes pertinents dans les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité reproductible et évolutive de préparation de grilles pour divers programmes de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études structurales.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des grilles, améliore la reproductibilité et diminue les besoins en échantillon.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en réduisant les goulots d'étranglement liés à la préparation des échantillons.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement adaptés au risque des cibles validées sur le plan structural.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation du graphène et la préparation de grilles de cryoME.
- Exige un accès à des dispositifs de rotation (spin coaters), à des unités de traitement par décharge luminescente (glow discharge) et à des nettoyeurs à ozone-UV.
- Implique une standardisation entre équipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les différents systèmes macromoléculaires ou types d'échantillons.
- Les limitations pratiques incluent la fragilité du matériau et la préservation de l'intégrité de la monocouche lors du transfert.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
