Génération et analyse d’images histologiques à paramètres élevés avec la cytométrie en flux histologique
21 juin 2024
La description ici est une méthode qui peut être utilisée pour imager cinq paramètres fluorescents ou plus par microscopie immunofluorescente. Un pipeline d’analyse permettant d’extraire des cellules uniques à partir de ces images et d’effectuer des analyses de cellules uniques à l’aide de stratégies de type cytométrie en flux est décrit, qui permet d’identifier des sous-ensembles de cellules dans des coupes de tissus.
Notre objectif principal est d’étudier comment les cellules du système immunitaire et les cellules gliales du système nerveux central contribuent au développement et à la progression de troubles neurologiques tels que la sclérose en plaques. La microscopie immunofluorescente est une technique standard et largement utilisée dans les disciplines biologiques et est essentielle à la recherche en neurosciences et en immunologie. L’un des principaux problèmes qui tourmentent les chercheurs est que la microscopie immunofluorescente est généralement limitée dans le nombre de sondes pouvant être imagées en une seule fois en raison des limites des microscopes conventionnels.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode permettant d’augmenter le nombre de sondes que de nombreux microscopes peuvent imager en même temps, et de fournir un pipeline d’analyse pour traiter des images à forte densité d’informations. L’avantage de ce protocole est qu’il peut être adapté à de nombreux microscopes largement disponibles et qu’il est facile à exécuter, ce qui rendrait l’analyse histologique multiplex accessible à un plus grand nombre de laboratoires.
Aperçu
Cette étude décrit une méthode d'imagerie de plusieurs paramètres fluorescents par microscopie immunofluorescente, ainsi qu'un pipeline pour l'analyse de données à l'échelle cellulaire unique. La méthode améliore les capacités d'imagerie traditionnelles, permettant l'identification de sous-populations cellulaires liées aux fonctions des cellules immunitaires et gliales dans les troubles neurologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La microscopie en immunofluorescence est une technique essentielle en neurosciences et en immunologie.
- Des limitations existent dans les microscopes conventionnels concernant le nombre de sondes pouvant être imagées simultanément.
- La méthode proposée vise à surmonter ces limitations et à rendre l'analyse histologique multiplexe plus accessible.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole permettant l'imagerie et l'analyse de plusieurs marqueurs fluorescents.
- Créer un pipeline d'analyse prenant en charge l'analyse au niveau cellulaire unique, similaire à la cytométrie en flux.
- Permettre une meilleure compréhension du rôle des cellules immunitaires et gliales dans les troubles neurologiques.
Méthodes utilisées
- La microscopie en immunofluorescence a été utilisée sur des coupes tissulaires colorées.
- L'étude détaillait une approche étape par étape pour configurer le microscope et effectuer la compensation de la fluorescence.
- L'analyse des images impliquait l'utilisation d'outils logiciels pour séparer et étiqueter les cellules individuelles.
- Le protocole permet une adaptation à divers microscopes couramment utilisés.
Résultats principaux
- La méthode différencie efficacement les différents types cellulaires dans le tissu lymphatique coloré.
- Un apprentissage automatique a été utilisé pour séparer avec succès des cellules étroitement regroupées.
- L'analyse a fourni des informations significatives sur les populations cellulaires présentes dans les sections de tissu.
Conclusions
- Ce protocole améliore les capacités de la microscopie immunofluorescente traditionnelle.
- Le pipeline établi rationalise les analyses au niveau de la cellule unique, permettant un accès accru à l'histologie multiplexe.
- Les résultats peuvent améliorer notre compréhension des mécanismes cellulaires impliqués dans les troubles neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie histologique à paramètres élevés avec la cytométrie histoflow répond à un goulot d'étranglement critique dans le profilage des cellules immunitaires en permettant une analyse spatiale multiplexée à résolution unicellulaire. Cette capacité améliore la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques, notamment pour des tissus complexes comme le SNC. L'approche soutient les décisions de portefeuille en intégrant le contexte spatial à une analyse quantitative des sous-populations de cellules immunitaires, orientant ainsi la découverte précoce et la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de la diversité des cellules immunitaires et gliales au sein de l'architecture tissulaire intacte.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en cartographiant les sous-ensembles cellulaires et leurs interactions spatiales.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à une analyse multiplexée de marqueurs à haut contenu.
- Améliore la confiance prédictive dans le choix des cibles dans les pipelines de neuroimmunologie.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes tissulaires validés et riches en informations pour des protocoles de criblage en aval.
- Standardise les résultats quantitatifs au niveau monocellulaire en utilisant des stratégies de sélection comparables à celles de la cytométrie en flux.
- Permet un profilage reproductible des populations cellulaires dans diverses conditions expérimentales.
- Facilite le développement d'essais évolutifs en s'adaptant à des plateformes microscopiques largement disponibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la cartographie des sous-ensembles de cellules immunitaires avec des modèles de tissus du SNC pertinents pour la maladie.
- Préserve la continuité spatiale et phénotypique, de la découverte à la validation préclinique.
- Permet une progression ajustée au risque en quantifiant l'abondance des types cellulaires et leurs interactions tissulaires.
- Fournit des informations traductionnelles sur les biomarqueurs pour la recherche sur les troubles neurologiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la découverte précoce et la recherche translationnelle en combinant l'imagerie multiparamétrique à l'analyse à l'échelle de la cellule unique, soutenant ainsi les flux de travail allant de la vérification d'hypothèses à la validation de modèles précliniques.
- Biologie de la découverte : Fait progresser la vérification d'hypothèses en permettant le profilage multiplexé des cellules selon leur localisation spatiale et leurs caractéristiques phénotypiques.
- Essais de criblage : Fournit des données quantitatives et reproductibles au niveau monocellulaire pour un développement d'essais robuste.
- Analytique : Propose des seuils de sélection similaires à ceux de la cytométrie en flux ainsi que des sorties statistiques destinées à l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Relie les données sur les sous-populations cellulaires immunitaires aux microenvironnements tissulaires pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Offre un pipeline d'imagerie et d'analyse largement adaptable à divers systèmes tissulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur les cellules immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'imagerie et l'analyse multiplexe à travers différentes plateformes et équipes.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller de l'avant et une gestion efficace du portefeuille en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes en neurosciences et en immunologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie immunofluorescente et en séparation spectrale.
- Suppose l'accès à des microscopes compatibles et à des logiciels avancés d'analyse d'images.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de marquage, d'imagerie et de sélection des populations cellulaires.
- Adaptable à divers types de tissus, mais peut nécessiter une optimisation pour des modèles spécifiques.
- La complexité de l'analyse d'images et la maîtrise des logiciels sont des facteurs pratiques à prendre en compte.
