Quantification du comportement de toilettage de Drosophila melanogaster pour l’évaluation des phénotypes de toilettage excessif

Notre recherche évalue les comportements de toilettage chez Drosophila melanogaster après l’inactivation d’Atg8a médiée par l’ARNi pour modéliser les déficits GABARAP observés chez les patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette. Notre objectif est de comprendre le rôle d’aAtg8a dans le développement comportemental, en fournissant des informations sur les fonctions régulatrices de son homologue humain dans les processus neuro-comportementaux. Les défis expérimentaux actuels de la méthode d’annotation manuelle comprennent le processus analytique complexe, tel que l’annotation et la révision des séquences, et la subjectivité impliquée dans l’annotation manuelle.

Les méthodes automatisées sont également confrontées à des défis, notamment la nécessité d’une expertise substantielle en informatique pour être mises en œuvre et exécutées efficacement. Nous avons constaté que le gène Atg8a joue un rôle dans le développement du comportement des mouches des fruits au-delà de ce qui a été établi précédemment. Plus précisément, nous avons constaté qu’il régule à la fois le toilettage et l’apprentissage, ce qui suggère que les orthologues Atg8a peuvent jouer des rôles similaires dans d’autres organismes.

Cette technique permet de quantifier directement la fréquence et la distribution du toilettage chez la drosophile. Il est particulièrement utile dans les laboratoires incapables d’utiliser des méthodes automatisées et permet une analyse plus détaillée que les méthodes indirectes à base de colorants. Dans l’ensemble, notre recherche fait progresser l’utilisation de la drosophile comme organisme modèle pour l’étude des troubles neurodéveloppementaux qui présentent un comportement obsessionnel-compulsif tel que le syndrome de Gilles de la Tourette.

Cela s’ajoute également aux preuves de plus en plus nombreuses que les protéines liées à l’autophagie jouent un rôle dans le développement comportemental. Pour commencer, placez quatre plats à trois puits côte à côte sur une surface blanche et couvrez chaque plat avec une lame en verre. Placez une caméra au-dessus de la vaisselle.

Assurez-vous qu’il n’y a pas d’éblouissement sur les glissières qui pourrait limiter la visibilité des mouches dans le plat et ajustez la position de la plaque ou tamisez les lumières au besoin pour éliminer l’éblouissement. Marquez maintenant la position de la parabole et de la caméra sur le banc où se déroule l’enregistrement. Placez les mouches de quatre à neuf jours sur un bloc de glace recouvert de parafilm et d’une serviette en papier pour les anesthésier légèrement.

Une fois anesthésiées, déplacez les mouches vers les chambres d’observation le plus rapidement possible à l’aide d’un pinceau. Placez une mouche dans chaque puits de la parabole à trois puits, en veillant à ce que les perturbations soient minimales pour éviter de provoquer des changements de comportement induits par le stress. Après avoir acclimaté les mouches 30 minutes après l’anesthésie, enregistrez les mouches à l’aide d’une caméra, puis ouvrez le terminal et tapez cd PiSpy.

Tapez python3 PiSpy. py, puis entrez la durée d’enregistrement et la fréquence d’images souhaitées. Sélectionnez la résolution souhaitée et cliquez sur Capture rapide.

Utilisez maintenant la fonction de prévisualisation de la caméra dans Pi Spy pour vous assurer que les mouches sont nettes et suffisamment visibles. Enregistrez les mouches pendant 10 minutes à la fréquence d’images recommandée de 24 images par seconde et enregistrez le fichier. Pour analyser la vidéo, importez le fichier dans le logiciel ELAN 6.8 pour une annotation détaillée et une analyse approfondie des comportements de toilettage.

Sélectionnez Niveau, Ajouter un nouveau niveau, tapez l’emplacement dans l’antenne dans le nom du niveau et ajoutez pour attribuer chaque ligne afin d’annoter manuellement les séquences des individus. Pour annoter des comportements, double-cliquez sur le niveau à annoter, cliquez avec le bouton droit de la souris et faites glisser le curseur le long du niveau sélectionné pendant une période au cours de laquelle un seul combat de toilettage est présenté. Cliquez avec le bouton gauche de la souris pour sélectionner une nouvelle annotation et double-cliquez sur la période nouvellement mise en surbrillance pour saisir l’abréviation du comportement observé à ce moment-là.

Une fois la vidéo entièrement annotée, obtenez une ventilation de chaque comportement en cliquant sur Afficher, puis sur Statistiques d’annotation. Identifiez le toilettage antérieur comme étant le toilettage effectué dans la région antérieure du corps de la mouche. Identifiez le toilettage postérieur comme un toilettage effectué à l’extrémité avant-postérieure du corps de la mouche.

Les épisodes de toilettage ont considérablement augmenté chez les mutants ARNi Atg8a par rapport aux groupes témoins. Le temps passé à se toiletter était également significativement plus élevé chez les mutants de l’ARNi Atg8a par rapport aux témoins. Aucune différence significative n’a été observée dans la distribution des comportements de toilettage antérieurs par rapport aux comportements postérieurs.