Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

Cette recherche se concentre sur les matériaux biologiques mous et vise à explorer les mécanismes physiques sous-jacents qui régulent la forme et l’organisation et les matériaux inspirés des cellules biologiques.

Les systèmes biologiques et modèles in vitro sont intrinsèquement complexes avec de nombreux pièges, et la préparation des échantillons est essentielle à leur reproductibilité. Ce protocole est conçu pour améliorer la reproductibilité de ces systèmes.

Ces résultats ouvrent la voie à la détection, à la caractérisation des mécanismes et à la compréhension de la fonction des forces physiques et des biomatériaux. Cela peut être généralisable à divers biopolymères et organites.

[Narrateur] Pour commencer, préparez l’échantillon à charger en ajoutant cinq microlitres de tampon 10XF dans un micro tube à centrifuger et ajoutez un volume d’eau distillée désionisée de sorte que le volume final de l’échantillon soit de 50 microlitres après l’ajout des composants restants. Pipetez un microlitre de bêta-mercaptoéthanol à 25 %, un microlitre de 225 milligrammes par millilitre de glucose, un microlitre d’un mélange de glucose oxydase et 85 000 unités par millilitre de catalyseur dans la solution. Ajoutez ensuite un microlitre de 25 millimolaires d’ATP et 10 microlitres de 2 %, 15 centipoises de méthylcellulose, et mélangez soigneusement par pipetage. Pour commencer la polymérisation de l’actine, mélangez l’actine non marquée avec l’actine marquée et ajoutez le mélange d’actine à la solution tampon F préparée. Pipetez la solution de haut en bas pour assurer un bon mélange. Laissez l’actine polymériser à température ambiante dans le tube de micro-centrifugeuse. Ensuite, pour préparer une cellule d’écoulement, placez deux morceaux de ruban adhésif double face parallèles l’un à l’autre sur la largeur de la lame de microscope pour former les limites du canal de la cellule d’écoulement. Placez la lamelle sur le canal de la bande en vous assurant qu’elle est perpendiculaire à la lame du microscope. Appuyez sur la zone de la lamelle qui est en contact avec le ruban adhésif double face pour créer une bonne étanchéité et éliminer les poches d’air. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez tout excès de ruban adhésif de la lame de microscope et de la lamelle de manière à ce que le seul ruban visible se trouve dans le canal de l’échantillon. Pour préparer une chambre d’échantillonnage de cylindre pour deux échantillons de déplanteur, rincez d’abord la lamelle avec de l’éthanol, de l’eau et de l’éthanol. Séchez-le à l’air filtré. Appliquez une fine couche d’époxy de cinq minutes pour faire adhérer le cylindre de clonage de verre à la lamelle. Ajoutez 3,5 microlitres de solution de tensioactif d’huile dans un microtube à centrifuger transparent ou de couleur claire. Sans mélanger, pipetez cinq microlitres de la solution d’actine sur le dessus de la couche de tensioactif d’huile. Fermez le tube. Tenez le haut du tube de micro-centrifugeuse et effleurez le bord inférieur pour former une mousse initiale avec une émulsion visible et continuez à effleurer jusqu’à ce qu’elle forme des micro-émulsions uniformes. Avant de charger la cellule d’écoulement, mélangez une petite quantité d’époxy de cinq minutes. Pour charger une cellule d’écoulement, pipetez un à trois microlitres de solution de tensioactif d’huile dans le canal d’échantillon de la cellule d’écoulement pour créer un petit bouchon qui mouille le canal. Inclinez la cellule d’écoulement pour éliminer tout espace d’air qui se forme en raison du ménisque du tensioactif d’huile qui se retire avant d’ajouter l’échantillon. Pipeter immédiatement la suspension d’émulsion de la solution d’échantillon à l’entrée de la cellule d’écoulement pour remplir le canal. Scellez chaque côté du canal de la cellule d’écoulement avec de l’époxy pendant cinq minutes. Pour charger la chambre d’échantillonnage du cylindre pour les échantillons sans émulsion, pipetez cinq microlitres de solution de tensioactif d’huile dans le fond de la chambre du cylindre de verre. Inclinez et tournez lentement la lamelle de recouvrement pour enduire la surface et abaissez le cylindre avec la solution tensioactive. Retirer l’excès de solution tensioactive d’huile à l’aide d’une pipette pour obtenir une fine couche tout en empêchant l’évaporation complète de l’huile. Ajoutez immédiatement la solution d’échantillon dans la chambre. Couvrez la chambre avec un petit morceau de polytétrafluoroéthylène, ou ruban PTFE, pour éviter l’évaporation et l’écoulement. Montez l’échantillon sur la platine du microscope. Démarrez l’imagerie time-lapse de l’actine à l’aide d’un objectif 20x, 40x, 60x ou 100x avec immersion dans l’huile ou dans l’eau pour garantir une ouverture numérique suffisamment élevée pour l’imagerie haute résolution. En cas de polymérisation dans une chambre d’échantillonnage, laissez la polymérisation pendant environ 30 minutes ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’allongement ou de mouvement visible du filament. Ajoutez un réticulant à l’échantillon, puis ajoutez de la myosine sous forme de filaments pré-polymérisés en pipetant lentement environ la moitié du volume total dans l’échantillon. Enfin, lancez l’imagerie en accéléré. L’image représentative de la fluorescence confocale du réseau d’actine intriqué est présentée ici. Le réseau d’actine intriqué est uniformément réparti sur toute la surface. Les points brillants dans cette image représentent des chevauchements de filaments, tandis que les régions sombres indiquent une présence minimale d’actine. Les fluctuations thermiques entraînent des changements d’intensité locaux et une flexion visible des filaments d’actine. L’ajout de myosine II provoque une flexion et une réorganisation du réseau d’actine avec une accumulation visible de myosine ponctuée à de longues périodes. La contraction du réseau dépend de la concentration de myosine et de la concentration en ATP. Dans les réseaux d’actine réticulés, la contraction induite par la myosine conduit à un mouvement coordonné sur des échelles de longueur plus longues par rapport aux réseaux intriqués.