Exploration de l’application de la biodétection basée sur la diffusion Raman améliorée en surface des sEVs individuels dans le diagnostic et la thérapie des maladies

Nous utilisons la diffusion Raman améliorée en surface combinée à l’apprentissage automatique pour traiter les diagnostics précoces du cancer, tout en fournissant des applications biomédicales. Un défi expérimental clé est l’hétérogénéité inhérente des échantillons d’exosomes, les données spectroscopiques hautement complexes et de haute dimension, qui est en outre aggravée par un faible rapport signal/bruit. Pour commencer, pipetez environ cinq microlitres de l’échantillon de petite vésicule extracellulaire sur le substrat plasmonique désigné.

Placez le substrat dans un dessiccateur pour laisser sécher complètement la gouttelette pendant environ 15 minutes. Ensuite, transférez le substrat séché dans un microscope Raman confocal. En utilisant le logiciel d’instrument WiRE version 4.4, lancez la collecte de données.

Réglez le laser d’excitation à 785 nanomètres à cinq milliwatts et calibrez le système. Pour acquérir des spectres à partir du substrat doré, effectuer un scan de reconnaissance sur une zone de 300 par 300 micromètres afin de localiser des vésicules individuelles en mode statique avec une taille de pas de 10 micromètres, une exposition de 0,1 seconde et une puissance laser de 50 %. Une fois les vésicules localisées, effectuer une cartographie haute résolution en mode statique sur une grille de cinq par cinq en utilisant une taille de pas d’un micromètre, une exposition de 0,2 seconde par point et une puissance laser de 50 %.

Ensuite, acquérez des spectres du substrat de graphène en effectuant les scans suivants. Examinez les spectres bruts initiaux et excluez ceux qui présentent un bruit excessif ou des formes spectrales anormales. Appliquez un filtre Savitsk-Golay à chaque spectre pour réduire le fond de fluorescence et lisser les données spectrales.

Calculez le rapport signal/bruit pour chaque spectre en utilisant soit la méthode pic/ligne de base, soit la méthode de l’écart-type. Pour chaque spectre, calculez le rapport signal/bruit comme le rapport entre l’intensité maximale après soustraction de base dans une bande Raman représentative et l’écart-type du bruit. Estimer le bruit en soustrayant une version lissée par Savitsky-Golay du spectre, en utilisant une taille de fenêtre de 11 et un ordre polynomial de trois du spectre original.

Classez tous les spectres par ordre croissant du rapport signal/bruit et évaluez la persistance des pics diagnostiques à travers les spectres classés afin de déterminer le seuil. Ensuite, fixez le seuil au point où l’un de ces pics disparaît dans le bruit de base, correspondant à un rapport signal/bruit de 28. Excluez les spectres qui sont inférieurs au seuil du rapport signal/bruit de 28 afin de garantir que seuls des spectres de haute qualité soient conservés pour l’analyse en aval.

Et normaliser chaque spectre restant soit à son intensité maximale maximale, soit à la surface totale sous la courbe. Attribuez une étiquette à chaque mesure spectrale en fonction de son origine, comme un patient atteint d’un cancer gastrique ou un témoin en bonne santé. Entrez les données spectrales marquées dans un classificateur de vecteur de support avec un noyau linéaire et appliquez un mélange stratifié pour une validation croisée en cinq fois afin d’assurer une représentation équilibrée dans chaque pli.

Maintenant, faites la moyenne des métriques de précision sur tous les folds pour évaluer la performance globale du modèle. Enfin, utilisez l’analyse discriminante linéaire, ou LDA, pour réduire la dimensionnalité du jeu de données de diffusion Raman amélioré en surface pour la visualisation. Utiliser le modèle entraîné d’analyse discriminante linéaire pour effectuer une classification directe entre les groupes d’échantillons.

Les spectres Raman avec les spectres moyens correspondants ont révélé des signatures moléculaires distinctes à travers chaque type d’échantillon acquises à partir de petites vésicules extracellulaires isolées à partir d’échantillons de tissu, de sang et de salive. L’analyse discriminante linéaire a révélé un regroupement clair des données vésiculaires extracellulaires selon leur tissu source, leur sang ou leur salive. La classification binaire utilisant un classificateur machine à vecteur de support a atteint la plus grande précision pour les échantillons de tissu à 90,1 %, suivie du sang à 70,9 % et de la salive à 60,7 %, les divisions de classification basées sur LDA ont clairement séparé les échantillons sains du cancer gastrique dans les données de vésicules extracellulaires issues des tissus.

Des divisions similaires de classification basées sur la LDA pour les données extracellulaires de vésicules extracellulaires issues du sang et de la salive ont montré une séparation moins optimale entre les échantillons sains et les échantillons de cancer. Les spectres Raman de vésicules incubées par doxorubicine sans graphène ont montré des pics constants d’environ 1 081, 1, 206 et 1 440 centimètres inverses. Avec le graphène, un pic D supplémentaire d’environ 1 350 centimètres inverses, et un pic de G d’environ 1 580 centimètres inverses ont été observés servant de standards internes.

Le rapport entre le pic de doxorubicine à 442 centimètres inverses et le pic de graphène G augmentait avec des concentrations de médicaments plus élevées et des temps d’incubation plus longs. Nous avons mis en place une empreinte biochimique par une seule vésicule pour distinguer les sources de maladies montrant un potentiel de diagnostic précoce. Trois avantages clés de notre technique.

Premièrement, c’est très sensible. Deuxièmement, c’est non invasif. et troisièmement, il ne nécessite pas de lyser ni de décomposer physiquement les particules.

À l’avenir, nous corrélérons le profil spectral au profil protéomique, ce qui, à son tour, aiderait à corréler le contenu exomique avec des fonctions spécifiques, telles que la communication cellulaire et le transport.