Une technique simple de microaspiration pour isoler les cellules somatiques du sperme équin cryopréservé en tant que donneurs nucléaires pour le clonage
19 décembre 2025
Ce protocole présente une technique simple de microaspiration pour isoler des cellules somatiques (SC) viables à partir du sperme équin cryopréservé. Contrairement aux approches traditionnelles, cette technique évite les longues cultures in vitro et permet de contourner la contamination par les spermatozoïdes, permettant une utilisation immédiate dans le clonage des cellules somatiques.
Nous visons à montrer que les cellules somatiques issues du sperme équin cryopréservé peuvent être utiles pour récupérer des individus ayant une forte valeur génétique. Notre défi actuel est de pouvoir sélectionner des cellules somatiques avec de l’ADN diploïde intact à utiliser comme donneur nucléaire. Pour commencer, retirez les pailles de sperme équin de la cuve d’azote liquide.
Exposez-les à l’air pendant 10 secondes, puis décongelez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Prélève un échantillon de 250 microlitres du sperme décongelé. Diluez-le avec un millilitre de medium DMEM-F12 complété.
Incubez le mélange de sperme à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pipettez 25 microlitres de la dilution incubée dans un tube, puis diluez-les dans 975 microlitres de DPBS complétés avec 0,1 milligramme par millilitre d’alcool polyvinylique ou de polyvinyl pyrrolidone. Mélangez doucement la suspension.
Maintenez le mélange de sperme dilué à 37 degrés Celsius pendant tout le processus de collecte cellulaire. Placez un couvercle en boîte de Petri contenant du sperme équestre dilué sur la scène du microscope pour préparer la collecte des cellules somatiques. Sélectionnez une micropipette de diamètre approprié pour la collecte des cellules somatiques et connectez-la au système d’aspiration mécanique.
Insérez soigneusement la micropipette dans la micro-goutte et alignez-la avec la base du couvercle de la vaisselle. Une fois que la pipette aspire le milieu de culture, commencez la capture individuelle des cellules somatiques. Concentrez-vous sur le bas de la micro-chute, où différentes morphologies cellulaires sont visibles.
Placez la pointe de la micropipette à côté de chaque cellule somatique, et aspirez sous pression négative. Collectez toutes les cellules rondes et allongées, quelle que soit leur taille. Après avoir collecté 10 cellules, déposez-les dans une micro-goutte de 10 microlitres située sur la surface supérieure du couvercle de la vaisselle.
Conservez toutes les cellules somatiques collectées dans cette micro-chute pendant tout le processus de collecte. Une fois le nombre désiré de cellules somatiques collecté, effectuez une procédure de lavage simple à l’aide de micro-gouttes pour éliminer les spermatozoïdes, les débris et les contaminants microbiens. À l’aide d’un second couvercle pour vaisselle, effectuez un lavage séquentiel en trois étapes des cellules somatiques.
Utilisez une micropipette pour transférer les cellules somatiques dans la première goutte, et laissez-les reposer pendant trois à cinq minutes. Transférez les cellules de la première goutte à la seconde en suivant la même procédure. Répétez le transfert une fois de plus et placez les cellules somatiques dans la troisième goutte.
Enfin, déposer les cellules somatiques isolées dans une micro-goutte préparée destinée au transfert nucléaire des cellules somatiques. La technique de micro-aspiration a permis de récupérer avec succès des cellules somatiques à partir du sperme équin cryopréservé, avec des taux de capture allant de 317,7 à 424,7 cellules par heure sur trois étalons. L’étalon numéro 3 montre le rendement le plus élevé.
Cinq types de cellules somatiques distincts ont été identifiés en fonction de leur taille et de leur morphologie. Nous avons identifié une population de cellules somatiques qui diffère par la morphologie et la viabilité du sperme équin cryopréservé, qui pourrait être utile comme donneur nucléaire. Les cellules peuvent être sélectionnées en fonction de leur morphologie, et la procédure ne nécessite pas l’établissement d’une culture primaire.
Nous nous concentrerons sur l’amélioration de la viabilité de ces cellules après la masse du sperme équin.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole décrit une technique de microaspiration permettant d'isoler des cellules somatiques viables à partir de semence équine congelée. Cette méthode évite les cultures in vitro prolongées et la contamination par des spermatozoïdes, permettant une utilisation immédiate en clonage de cellules somatiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie de la reproduction
Contexte
- Des cellules somatiques peuvent être obtenues à partir de sperme équin cryoconservé.
- L'isolement de cellules somatiques viables est essentiel aux fins de clonage.
- Les méthodes traditionnelles impliquent souvent des durées de culture prolongées.
- Une contamination par les spermatozoïdes peut entraver le processus de clonage.
Objectif de l'étude
- Démontrer une technique d'isolement de cellules somatiques à partir de sperme équin.
- Permettre l'utilisation de ces cellules pour cloner des individus de grande valeur génétique.
- S'assurer que les cellules somatiques sélectionnées possèdent un ADN diploïde intact.
Méthodes utilisées
- Dégel des pailles de sperme équin provenant de l'azote liquide.
- Utilisation d'un bain-marie à 37 degrés Celsius pour le dégel.
- Prélèvement et dilution du sperme dégelé avec un milieu DMEM-F12 supplémenté.
- Application d'une technique de microaspiration pour l'isolement cellulaire.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules somatiques viables.
- Réduction de la contamination par les spermatozoïdes au cours du processus.
- Utilisabilité immédiate des cellules isolées pour le clonage.
- Préservation de l'intégrité de l'ADN diploïde dans les cellules sélectionnées.
Conclusions
- La technique de microaspiration est efficace pour l'isolement des cellules somatiques.
- Cette méthode améliore le potentiel de clonage des cellules somatiques chez les équidés.
- Des applications futures pourraient permettre une meilleure récupération génétique en élevage équin.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La récupération efficace de cellules somatiques viables à partir de semence équine cryoconservée répond à un goulot d'étranglement critique dans l'utilisation des ressources génétiques pour les technologies reproductives avancées. Cette technique de microaspiration permet un accès immédiat à des cellules donneuses diploïdes pour le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT), en évitant la nécessité d'une culture prolongée et en réduisant la contamination par les spermatozoïdes. Cette approche élargit les possibilités de sauvetage génétique et de diversification du portefeuille dans les chaînes de biotechnologie animale.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe de la viabilité des cellules somatiques et de leur statut diploïde à partir d'échantillons cryopréservés.
- Prend en charge la validation fonctionnelle de l'adéquation du noyau donneur pour les protocoles de transfert nucléaire somatique (SCNT).
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant la sélection morphologique des cellules donneuses.
Développement de criblages et de tests
- Offre une méthode rapide et reproductible pour isoler des cellules somatiques exemptes d'interférences dues aux spermatozoïdes.
- Fournit des populations cellulaires standardisées pour des tests de clonage en aval, sans nécessiter l'établissement d'une culture primaire.
- Permet une évaluation quantitative du rendement cellulaire et de la morphologie afin d'optimiser le procédé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Améliore la continuité entre le banquage des ressources génétiques et les applications précliniques de clonage.
- S'inscrit dans les objectifs translationnels en permettant la récupération de génotypes de haute valeur à partir de matériel archivé.
- Réduit le risque biologique en assurant l'intégrité des cellules donneuses avant la génération d'embryons.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de microaspiration s'intègre à l'interface de la récupération des ressources génétiques et du clonage fondé sur le transfert nucléaire de cellules somatiques, reliant le banquage par cryoconservation à la préparation immédiate du donneur nucléaire.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la viabilité cellulaire et l'intégrité génétique des cellules donneuses issues de sources cryoconservées.
- Tri : Normalise l'isolement des cellules somatiques pour une entrée reproductible en transfert nucléaire de cellule somatique (SCNT).
- Analyse : Permet la mesure quantitative du rendement cellulaire et de la diversité morphologique.
- Recherche translationnelle : Associe les sémens conservés dans des biobanques à des protocoles de clonage applicables pour le sauvetage génétique.
- Réutilisation institutionnelle : Établit un protocole réutilisable pour des fonds génétiques variés et des échantillons archivés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive quant à l'adéquation des cellules donneuses et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT).
- Valeur opérationnelle : Simplifie l'isolement des cellules, améliore la reproductibilité et élimine les étapes longues de culture.
- Valeur stratégique : Permet des décisions rapides de type « aller/non-aller » pour les projets de récupération génétique et optimise la répartition des ressources.
- Impact sur le portefeuille : Élargit la gamme de matériel génétique viable pour le clonage et les stratégies d'élevage ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en micromanipulation et en évaluation de la morphologie cellulaire.
- Requiert un accès à des systèmes d'aspiration mécanique et à une infrastructure microscopique.
- Exige une standardisation entre équipes pour la sélection des cellules et les procédures de lavage.
- Adaptable à divers échantillons de sperme, mais peut nécessiter une optimisation selon les espèces ou les conditions de conservation.
- La viabilité cellulaire après l'isolement peut varier et doit être surveillée en vue de la TNC.
