Un flux de travail pratique pour l'analyse des données de transcriptomique spatiale : de l'acquisition des données aux analyses avancées

Bonjour à tous. Dans cette vidéo, nous allons parcourir un pipeline pratique d'analyse de données de transcriptomique spatiale, depuis l'acquisition et le chargement des données jusqu'à l'exploration de base, puis enfin l'analyse avancée. Globalement, le flux de travail comprend trois étapes principales.

Étape 1 : tout d'abord, télécharger les données, ensuite, obtenir le code d'analyse, puis exécuter le pipeline afin de produire les résultats. Étape une, acquisition des données et préparation de la structure des répertoires. Commencez par obtenir des jeux de données publics de transcriptomique spatiale.

Téléchargez l'archive des données brutes. Extrayez ensuite l'archive. Organisez les fichiers selon une structure de répertoires normalisée.

Tout d'abord, créez un répertoire principal pour les données, puis créez un sous-répertoire dédié pour chaque échantillon. Transférez les fichiers essentiels suivants pour chaque échantillon dans le sous-répertoire correspondant. Ensuite, créez un sous-dossier spatial dans chaque répertoire d'échantillon.

Placez les fichiers suivants dans le sous-dossier spatial. Placez le fichier S1 des métriques de PC de caractéristiques filtrées dans le sous-répertoire principal de l'échantillon. Décompressez les fichiers gzip situés dans le dossier spatial.

Veillez à ce que les noms de fichiers d'origine restent exactement tels qu'ils sont requis par la fonction de chargement 10X spatial. Deuxième étape, configuration de l'environnement logiciel. Ici, nous passons outre l'installation du langage R et la diffusion des données commence par l'obtention du script d'analyse dans le dépôt GitHub.

Installez les packages R requis à partir de Graham dans le fichier conductor en exécutant le script setup R. Installez la suite auto en exécutant les commandes d'installation fournies dans la fiche documentaire officielle. Accédez à l'URL d'installation officielle pour récupérer les scripts de configuration. Initialisez l'environnement Python requis et les dépendances système conformément aux instructions de la page de configuration.

Obtenez l'outil personnalisé en accédant au dépôt GitHub et téléchargez le code source. Accédez au répertoire TOS et installez les dépendances Python. Étape trois : chargement des données spatiales et contrôle de qualité.

Lire les données spatiales dans un objet Seurat. Utiliser la fonction de lecture 10X pour charger manuellement l'image tissulaire à haute résolution. Spécifier l'image et le nom de l'image.

Utilisez la fonction load 10X spatial avec le paramètre image défini sur l'objet image créé à l'étape précédente et créez l'objet Seurat. Calculez les métriques de contrôle de qualité. Calculez le pourcentage de lectures mitochondriales à l'aide du paramètre percentage feature avec le motif mt.

Visualisez et interprétez les données en fonction des métriques de contrôle qualité. Générez des diagrammes en violon de nCount_Spatial, nFeature_Spatial et percent.mt à l'aide de la fonction de diagramme en violon.

Créer des graphiques spatiaux de ces métriques à l'aide de graphiques de caractéristiques spatiales. Identifier les points situés en dehors de la zone tissulaire. Optionnel : appliquer des filtres pour supprimer les points de faible qualité.

Après l'exécution du script, vous pouvez obtenir ces résultats, incluant les métriques de contrôle qualité et le tracé spatial des caractéristiques. Étape quatre : prétraitement des données, intégration et regroupement. Normaliser lors du prétraitement des échantillons individuels.

Appliquer, pour chaque échantillon séparément, une normalisation SC transform avec l'essai Spatial. Intégrer plusieurs échantillons. Préparer la liste des objets normalisés SCTransform en vue de l'intégration.

Veillez à ce que chaque objet possède un test ARN en copiant le test spatial. Utilisez les fonctions d'intégration sélectionnées dans l'intégration SCT PREP pour identifier les fonctions variables communes. Recherchez les ancres d'intégration à l'aide de la fonction « trouver les ancres d'intégration » avec la méthode de normalisation SCT.

Intégrez les données à l'aide de IntegrateData. Effectuez une réduction de dimensionnalité dans le regroupement sur le test intégré. Exécutez une ACP sur les données intégrées en utilisant runPCA.

Déterminez le nombre optimal de composantes principales pour l'analyse en aval en calculant la variance cumulée expliquée. Identifiez le point du coude par méthode programmée. Exécutez UMap en utilisant le nombre déterminé de composantes principales.

Regrouper les cellules à l'aide des fonctions FindNeighbors et FindClusters. Spécifier les PC déterminées dans la résolution définie à 0,5. Réaliser une analyse d'expression différentielle entre les groupes cibles à l'aide de la fonction FindWorkers.

Identifier les gènes variables spatialement. Pour chaque échantillon d'origine, exécuter la recherche de caractéristiques variables spatialement en utilisant la méthode de Moran I sur le test SCT afin de calculer l'autocorrélation spatiale. Après avoir exécuté ce script, vous pouvez obtenir le graphique du coude, le graphique UMap, le graphique des groupes, la carte thermique des marqueurs des groupes, le diagramme en volcan, les gènes différentiellement exprimés selon les caractéristiques spatiales, les gènes spatialement fiables et les marqueurs des couches du côlon.

Et le graphique en points des marqueurs de la couche du côlon, accompagné des marqueurs du graphique des caractéristiques spatiales. Étape cinq, prétraitement des données de référence unicellulaires. Lire la matrice de comptage d'ARN-séquençage unicellulaire à l'aide de read 10X et créer un objet Seurat.

Effectuez la normalisation de contrôle qualité standard et la dédoublonnisation. Calculez le pourcentage de lectures mitochondriales dans les cellules filtrées. Normalisez les données à l’aide de la transformation SC.

Définir une vara.to. régresser le pourcentage.mt. Réaliser l'analyse PCA et UMap et regrouper les cellules à l'aide de la méthode dynamique de sélection des composantes principales décrite dans les étapes précédentes, puis annoter les types cellulaires.

Calculer les scores de module pour les gènes marqueurs canoniques des types cellulaires à l'aide de AddModuleScore. Annoter les groupes en fonction des scores de module et des connaissances biologiques établies. En alternative, importer des annotations pré-calculées à partir des métadonnées.

Après avoir exécuté ce script, vous pouvez obtenir les métriques de contrôle qualité. Ils ont téléchargé la carte UMap par cluster, la carte UMap par échantillon et les scores de type cellulaire. Étape six : déconvolution guidée par référence à l'aide de SPOTlight.

Tout d'abord, préparez les données pour SPOTlight. Convertissez l'objet Seurat annoté de cellules uniques et l'objet Seurat spatial en un objet d'expérience de cellule unique. Normalisez les données de cellules uniques par logarithme à l'aide de LogMoreCounts.

Ensuite, exécutez la déconvolution SPOTlight. Commencez par identifier les gènes à forte variabilité dans les données unicellulaires à l'aide de ModelGeneVar. Calculez les marqueurs des types cellulaires à l'aide de score markers et filtrez pour obtenir des marqueurs de haute qualité.

Réduisez par sous-échantillonnage la référence unicellulaire pour chaque type cellulaire à un nombre gérable afin de diminuer le temps de calcul. Exécutez la déconvolution à l’aide de la fonction SPOTlight en fournissant la référence unicellulaire, les données spatiales, la liste de marqueurs et les gènes à haute variance (HVGs), puis visualisez et exportez les résultats. Vous pouvez obtenir le résultat de la déconvolution comme indiqué ici, présenté sous la forme d’un tracé en nuage de points.

Étape sept, déconvolution non supervisée avec Stdeconvolve. Commencez par préparer les données spatiales. Extrayez les métriques de nombre de lignes à partir de l'objet Seurat spatial en utilisant GetAssayData avec le slot counts.

Supprimez les taches et gènes de faible qualité à l'aide des comptages corrigés de STdeconvolve. Identifiez les types cellulaires latents pour les filtres exprimant quatre gènes dans une fraction minimale de taches, en utilisant la LDA stricte restreinte par la méthode reach pour appliquer ce modèle d'allocation à une gamme de nombres de thèmes potentiels à l'aide de fitLDA. Sélectionnez le modèle optimal sur la base de la complexité minimale en utilisant le modèle optimal avec opt min.

Analyser et visualiser les résultats. Extraire la proportion de sérotypes, Theta, et les profils génétiques Beta pour le modèle optimal à l'aide de getBetaTheta. Pour intégrer l'interprétation biologique des thèmes de corrosion, importer les annotations des régions d'intérêt générées par l'outil de sélection des points spatiaux.

Utilisez ces annotations comme paramètre de groupe dans la fonction avec tous les sujets. Appliquez au projet les proportions de types cellulaires déconvoluées en les replaçant sur les coordonnées spatiales et codez par couleur les points selon leur région d'intérêt (ROI). Après avoir exécuté le script, vous obtiendrez un résultat similaire à ceci, une carte d'échelle chargée, comme celles produites par SPOTlight.

Étape huit, communication spatiale entre cellules à l'aide de Giotto. Commencez par convertir l'objet Seurat en un objet Giotto. Utilisez la fonction createGiottoObject, en fournissant les métriques de faible nombre de lectures et les coordonnées spatiales.

Prétraitez l'objet Giotto et ajoutez le résultat de la déconvolution. Normalisez les données à l'aide de Giotto normalisé, puis ajoutez-les comme annotations de sérotype. Choisissez les métadonnées cellulaires à l'aide de addCellmetadata.

Créer un réseau spatial à l'aide de createSpatialNetwork. Charger une base de données de récepteurs et de ligands dans notre environnement. Exécuter explore CellCellcom pour identifier les interactions significatives entre ligands et récepteurs entre les types cellulaires situés en proximité spatiale.

Vous pouvez obtenir le diagramme en points de communication entre cellules comme suit. L'étape neuf est facultative. Sélection interactive des taches avec SelectSpatialSpot.

Préparez les données pour l'outil interactif à l'aide du script six. Extrayez les coordonnées spatiales de l'objet Seurat à l'aide de GetTissueCoordinates. Formatez et exportez les données.

Exporter le tableau de données formatif vers un fichier CSV. Ensuite, effectuer l'analyse de la région d'intérêt. Lancer le personnalisé.

Sélectionnez les applications en pointillés spatiaux et chargez le fichier CSV. Sélectionnez interactivement les points en fonction de leur emplacement spatial. Ensuite, exportez la liste des points sélectionnés et leur groupe attribué, étiquetée comme un nouveau fichier CSV.

Nous vérifions simplement ce que nous pouvons obtenir en exécutant le script un par un. Tous les résultats sont enregistrés dans le dossier résultats divisé en cinq parties. Et comme vous pouvez le voir, nous pouvons obtenir les métriques de contrôle qualité, et diviser.

Et vous pouvez vérifier le graphique des caractéristiques spatiales ici. De plus, le processus de déconvolution est effectué de manière supervisée et non supervisée. Les résultats de SPOTlight sont affichés ici.

Comme vous pouvez le constater, tous les spots contiennent les informations de proportion. Les résultats de la désconvolution non supervisée obtenus par STdeconvolve sont également générés ici. Et ceci est le résultat des clusters Seurat pour le spot dans les données spatiales.

Vous pouvez également les visualiser dans le graphique d'équipe spatial, comme ceci. De plus, vous pouvez également obtenir le résultat de communication entre taches grâce à Giotto. Ce flux de travail complet est entièrement open source à 100 %.

Analyse de type « spotting » allant des métriques d'expression à la modélisation spatiale avancée. Toutes les étapes s'exécutent sur une machine disposant de 16 Go de RAM. La base de code est modulaire, un script par tâche.

Remarquez que ce pipeline ne couvre pas le traitement en amont à partir du prix FASTQ. L'accent est mis sur les données spatiales en 2D, et inclut actuellement uniquement les outils de téléchargement de Visium. Voilà tout, merci d'avoir suivi cette vidéo.