Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes humains primaires à l’aide de tert-butyl hydroperoxyde

Notre recherche se concentre sur l'étude du phénotype de sénescence des mélanocytes et de sa contribution au vieillissement cutané extrinsèque. Les modèles établis de sénescence utilisent des fibroblastes et ne parviennent pas à rendre compte de la biologie propre aux mélanocytes. Ce protocole induit un stress oxydatif médié par le tBHP dans des mélanocytes humains primaires.

Pour commencer, rassemblez les réactifs nécessaires. Après avoir décongelé les mélanocytes et leur avoir permis de se rétablir pendant trois jours, assurez-vous que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % le jour du semis. Aspirez le milieu du flacon.

Lavez les cellules deux fois avec du DPBS. Ajoutez deux millilitres de solution de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placez le flacon dans l’incubateur pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Tapotez doucement le flacon. Puis, au microscope, observez les cellules afin de confirmer un détachement complet. Ajoutez un volume équivalent à 1,5 fois celui de l'inhibiteur de trypsine pour arrêter la réaction.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Diluez la suspension avec du DPBS jusqu'à un volume final de 10 millilitres. Effectuez une centrifugation de la suspension cellulaire à une force centrifuge relative de 100 pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans du milieu jusqu'au volume désiré. Semez 600 000 cellules par boîte de 10 centimètres pour les plaques traitées au tert-butyl hydroperoxyde, ou tBHP. Semez 400 000 cellules par plaque pour les plaques témoins.

Préparez une solution de travail de 10 millimolaire à partir du stock de tBHP en utilisant du DPBS ou du milieu. Ajoutez 100 micromolaire de tBHP aux cellules pendant une heure par traitement. Déplacez la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément le tBHP dans tout le milieu.

Placer les cellules dans l'incubateur exactement une heure à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Aspirer le milieu pour interrompre le traitement par le tBHP. Laver les plaques deux fois avec du DPBS préchauffé à 37 degrés Celsius.

Ajoutez le volume approprié de milieu frais dans les plaques. Placez les plaques dans l'incubateur et laissez les cellules se rétablir pendant au moins quatre heures avant le prochain traitement. Répétez la procédure de traitement plus tard le même jour pour le deuxième traitement.

Poursuivez le traitement jusqu'au jour quatre, puis maintenez les cellules en culture jusqu'au jour neuf afin d'évaluer les marqueurs de sénescence. Comptez les cellules traitées au tBHP et les cellules témoins. Repiquez-les à la même densité initiale, ou si moins de 600 000 cellules sont obtenues à partir des plaques traitées au tBHP, repiquez toutes les cellules collectées.

Compter les cellules aux jours quatre, neuf et quinze de la culture. Au jour neuf, laver les cellules deux fois avec du PBS. Fixer les cellules à l'aide de formaldéhyde à 2 % et de glutaraldéhyde à 0,4 %.

Lavez les cellules fixées deux fois avec du PBS. Incubez les cellules fixées dans une solution de coloration à pH 6. Couvrez la plaque pour la protéger de la lumière, puis incubez-la pendant 18 heures à 37 degrés Celsius en l'absence de dioxyde de carbone.

Lavez les cellules deux fois avec du PBS. À l’aide d’une microscopie en lumière, observez et comptez le nombre de cellules colorées en bleu. Divisez ce nombre par le nombre total de cellules dans le même champ.

Exprimez les résultats en pourcentage de cellules positives. Après l'induction du stress oxydatif, le traitement par le tBHP a réduit de manière significative la prolifération des mélanocytes par rapport aux témoins. Les cellules traitées ont atteint seulement 1,4 doublement cumulatif de la population, ou cPDL, au neuvième jour, tandis que les témoins ont atteint 3,1 cPDL.

Vers le jour 15, les cellules traitées atteignaient un plateau à 1,9 cPDL, tandis que les cellules témoins se développaient jusqu'à 5,1 cPDL. Les mélanocytes traités au tBHP présentaient une augmentation de la surface cellulaire par rapport aux témoins à tous les points temporels mesurés, l'élargissement progressant jusqu'au jour 15, ce qui est conforme à la morphologie élargie et aplatie des cellules sénescentes. Les mélanocytes traités au tBHP montraient une augmentation de l'activité de la bêta-galactosidase associée à la sénescence, ou activité SA-bêta-galactosidase, avec 32 % de cellules positives contre 3 % chez les témoins.

L'augmentation de la positivité à la SA-bêta-galactosidase était conforme à un phénotype sénescen. Une analyse par immunofluorescence a montré une augmentation des niveaux de gamma-H2AX dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux témoins. Les cellules traitées présentaient un signal gamma-H2AX plus intense que les témoins.

L'analyse par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel a démontré une augmentation de l'expression des facteurs du phénotype sécréteur associé au vieillissement, l'interleukine-8 présentant l'augmentation la plus importante, tandis que l'interleukine-6 et la métalloprotéinase matricielle-1 ont montré des augmentations modérées. L'analyse par immunotransfert a confirmé l'induction du vieillissement cellulaire.

La laminine B1 a montré une réduction significative dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux témoins. Les niveaux de la protéine du rétinoblastome phosphorylée étaient réduits dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux contrôles. Le traitement au tBHP a augmenté l'expression transcriptionnelle de p16 et de p21 dans les mélanocytes.

Ce modèle permet aux chercheurs d'étudier comment les mélanocytes sénescents affectent la pigmentation et communiquent avec les cellules environnantes via des facteurs inflammatoires SASP. La difficulté de ce protocole réside dans le respect précis du calendrier. Le tBHP doit être appliqué deux fois par jour avec un intervalle d'au moins quatre heures.

Suite à ce protocole, la sénescence peut être caractérisée à l'aide de la coloration par la bêta-galactosidase associée à la sénescence, de l'immunofluorescence, de la RT-qPCR et du Western blotting dirigé contre des marqueurs établis de la sénescence.