Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Notre laboratoire étudie le rôle des cellules tueuses naturelles dans la santé et la maladie, dans le but d'exploiter leur potentiel afin d'améliorer les traitements contre les cancers solides et hématologiques. Les dosages actuels de cytotoxicité des cellules NK manquent de normalisation entre les différentes plateformes et configurations expérimentales. Ce protocole propose des méthodes reproductibles d'imagerie en cellules vivantes et de cytométrie en flux pour une évaluation précise de la cytotoxicité.

Pour commencer, préparez 10 millilitres de SYTOX Orange 2x en diluant la solution mère de SYTOX Orange dans le milieu de culture NK-92 dans un tube conique de 15 millilitres à fond conique. Comptez les cellules cibles à l’aide d’un compteur Luna après les avoir mélangées au bleu de Trypan ou utilisez toute méthode de comptage cellulaire validée basée sur l’exclusion de colorant. Transférez la quantité requise de cellules cibles dans un tube conique de 15 millilitres à fond conique.

Centrifuger le tube à 300G pendant cinq minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Ensuite, re-suspendre les cellules cibles à une concentration finale de 250 000 cellules par millilitre dans un milieu contenant du SYTOX Orange 2X. Pour préparer la cellule effettrice, évaluer la viabilité et la concentration des cellules NK-92, et poursuivre uniquement si la viabilité est supérieure à 80 %, car une viabilité plus faible pourrait affecter la performance du test.

Compter et transférer le nombre requis de cellules NK-92 dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Après centrifugation, re-suspendre les cellules à une concentration finale de 500 000 cellules par millilitre. Préparer les dilutions de cellules effectrices en ajoutant 240 microlitres de cellules effectrices dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond rond pour un rapport effecteur:cible de deux pour un, et ajouter 120 microlitres de milieu dans les puits restants.

Réalisez des dilutions sérielles par deux, allant de deux à un à 0,25 à un (effecteur sur cible), en mélangeant soigneusement par pipetage au moins cinq fois et en changeant les embouts entre chaque transfert. Ensuite, pour installer la co-culture, récupérez la plaque de 96 puits à fond plat revêtue de polylysine. Juste avant le transfert, resuspendez soigneusement les cellules cibles et effectrices sans créer de bulles, puis ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits appropriés.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de PBS dans les puits inutilisés environnants. Faites centrifuger la plaque à 100 × g pendant deux minutes à température ambiante. Placez la plaque dans le système d'imagerie de cellules vivantes.

Acquérez des images toutes les heures pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Vérifiez la qualité des images après le premier balayage et ajustez les paramètres d'acquisition si nécessaire. Ajustez la séparation spectrale afin de corriger le recouvrement de SYTOX Orange dans le canal vert.

Vérifiez que les cellules mortes positives oranges ne soient pas identifiées par erreur comme des cellules positives vertes. Pour configurer l'analyse cellule par cellule de cellules non adhérentes, réglez le diamètre attendu de l'objet à 15 micromètres afin de correspondre au diamètre cellulaire approximatif. Réglez la sensibilité du seuil et la sensibilité de la texture à cinq, et la sensibilité des bords à 10 pour faciliter la séparation des agrégats cellulaires.

Définissez la plage du filtre de surface d'objet accepté entre 50 et 2 000 micromètres carrés afin d'exclure les débris et les objets de grande taille. Réglez l'excentricité maximale à 0,95 pour exclure les objets non cellulaires. Obtenez des cellules NK humaines primaires cultivées pendant 16 à 24 heures.

Transférez 500 000 cellules cibles dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres. Lavez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS. Centrifugez les cellules à 300G pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez le surnageant. Préparez une solution de travail de 0,5 micromolaire de carboxyfluorescéine succinimidyle ester ou CFSC dans du PBS en diluant un microlitre de solution mère de CFSE à cinq millimolaire dans 10 millilitres de PBS. Resuspendez le culot obtenu à environ un million de cellules par millilitre dans la solution de CFSE.

Incuber les cellules pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, enveloppées dans du papier d'aluminium pour les protéger de la lumière. Ensuite, arrêter la réaction en ajoutant cinq à dix volumes de milieu de culture, puis incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après centrifugation des cellules, re-suspendre le culot cellulaire à raison de 250 000 cellules par millilitre afin que 100 microlitres contiennent 25 000 cellules.

Ajoutez 100 microlitres par puits de cellules cibles dans les puits désignés d'une plaque 96 puits à fond rond à l'aide d'une pipette multicanal. Plaquez chaque condition en triple. Ensuite, préparez 200 microlitres de solution d'anticorps 4X dans le milieu de culture des cellules NK pour chaque anticorps testé et son contrôle d'isotype apparié.

Transférez les solutions d'anticorps dans une plaque à puits profonds. Ajoutez 50 microlitres de solution d'anticorps dans chaque puits contenant les cellules cibles, puis mélangez soigneusement en aspirant et en rejetant au moins cinq fois à l’aide d’une pipette. Ajoutez 50 microlitres de milieu de culture de cellules NK par puits dans les puits témoins sans anticorps et mélangez soigneusement par pipetage.

Incuber la plaque de 25 à 30 minutes dans des conditions d'incubation standard. Compter et obtenir 200 000 cellules NK, et poursuivre uniquement si la viabilité est supérieure ou égale à 75 %. Résuspender les cellules à raison de 250 000 cellules par millilitre dans 800 microlitres de milieu de culture de cellules NK humaines primaires. Ajouter 50 microlitres de cellules NK par puits dans les puits correspondants et mélanger soigneusement en pipetant haut et bas au moins cinq fois.

Ensuite, pipeter 50 microlitres par puits de milieu de culture dans les puits de contrôle et mélanger soigneusement. Inspecter attentivement la plaque 96 puits à fond rond pour s'assurer que tous les puits contiennent 200 microlitres avec des niveaux de ménisque uniformes et sans bulles. Centrifuger la plaque pendant deux minutes à 100G, puis l'incuber pendant 16 à 18 heures dans des conditions d'incubation standard.

Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 300G et éliminer le surnageant. Laver tous les puits avec 200 microlitres par puits de tampon de tri par cytométrie en flux ou tampon FACS. Préparer un mélange maître d'anticorps de surface dans du tampon FACS comme indiqué ici.

Resuspendez les cellules dans 50 microlitres par puits de mélange maître d'anticorps et mélangez soigneusement en aspirant et en expulsant au moins cinq fois à l’aide d’une pipette. Incubez la plaque pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, enroulée dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Ajoutez 150 microlitres par puits de tampon FACS.

Après la centrifugation, resuspendre les cellules dans 100 microlitres par puits de DAPI à cinq micromoles dans du tampon FACS. Passer immédiatement à l'acquisition en cytométrie en flux sans incubation préalable à l'acquisition. Réaliser la cytométrie en flux à l'aide de l'instrument Cytek Aurora et enregistrer les canaux de fluorescence pour CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI et tout autre fluorochrome supplémentaire.

Pendant la co-culture, les cellules effectrices, les cellules cibles vivantes et les cellules mortes ont été visualisées à l'aide d'une microscopie en temps réel de cellules vivantes. Les cellules NK-92 exprimant CAR2 et CAR3 ont présenté une cinétique de destruction plus rapide que les cellules CAR1-NK-92, en particulier aux premiers points temporels et à un rapport effecteur:cible égal. La destruction des cellules cibles a augmenté avec des rapports effecteur:cible plus élevés, y compris pour les cellules NK-92 de contrôle, qui ont démontré une cytotoxicité naturelle.

Les cellules NK-92 exprimant CAR2 et CAR3 ont démontré une plus grande puissance à des rapports effecteurs sur cibles plus faibles aux points temporels ultérieurs. Une puissance accrue à des rapports effecteurs sur cibles intermédiaires a été observée aux points temporels plus précoces. Trois paramètres, KR50, KT50 et IKI-50, ont été définis afin de quantifier la puissance des cellules CAR-NK-92, la cinétique de lyse et la performance cytotoxique globale au sein des populations d'effecteurs.

L'ajout de daratumumab seul n'a pas réduit la survie des cellules cibles, confirmant que l'anticorps n'avait aucun effet direct sur la viabilité des cellules cibles en l'absence de cellules effectrices. La co-culture avec les cellules NK seules a réduit la survie des cellules cibles à environ 70 %, indiquant une cytotoxicité naturelle de base. L'ajout de daratumumab a davantage réduit la survie cellulaire à environ 37 %, en accord avec une cytotoxicité médiée par les anticorps renforcée.

En revanche, la condition contrôle d'isotype a montré une survie d'environ 62 %, comparable à celle de la condition NK seule. La dégranulation des cellules NK était la plus faible dans la co-culture de cellules NK et de cellules cibles sans anticorps, et la plus élevée dans la condition traitée au daratumumab, à environ 31 %, tandis que le contrôle d'isotype présentait une dégranulation intermédiaire d'environ 19 %. Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier la cytotoxicité naturelle des cellules NK, d'évaluer la puissance de destruction tumorale de conceptions de CAR-NK, et de comparer l'efficacité de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) d'anticorps monoclonaux. Une considération essentielle lors de l'exécution de ce protocole est de maintenir un comptage, un pipetage et un ensemencement précis et constants des cellules NK et des cellules cibles afin d'obtenir des résultats fiables et interprétables.

De futures études pourront s'appuyer sur ces protocoles pour explorer l'évasion immunitaire des cellules NK, comparer la susceptibilité tumorale et évaluer de nouvelles immunothérapies basées sur les cellules NK dans divers cancers.