Isolement des neutrophiles Protocole

Protocole d'isolement des neutrophiles. Cette procédure permettra d'extraire les globules blancs à partir d'un échantillon de sang total à l'aide d'un équipement comprenant une centrifugeuse et des flacons. Agiter vigoureusement, seringue et aiguille, filtre stérile pour seringue.

Matériaux Milli pour marque MX gv 0,22 micromètre. La séparation des neutrophiles par le procédé de Hank nécessite deux types de solutions HBSS. La HBSS contenant du chlorure de calcium sera utilisée pour préparer une solution avec de l'albumine sérique humaine.

Le HBSS sans chlorure de calcium sera utilisé pour suspendre et laver les neutrophiles. Veuillez prendre soin d'utiliser la solution de HBSS appropriée dans cette procédure. L'albumine sérique humaine ou HSA est une protéine du plasma sanguin qui maintient le pH et la pression onmotique.

Ne pas utiliser le tampon d'hémolyse à base d'amalgame de sérum bovin. Ce produit est fabriqué par Roche Diagnostics, le milieu d'isolement des polynucléaires NIM de Cedar Line Labs, le milieu de séparation Lymph light Poly, à protéger de la lumière et à conserver au réfrigérateur pour de meilleurs résultats. Tous les réactifs doivent être à température ambiante au moment de l'utilisation.

Retirer les réactifs du réfrigérateur une heure avant l'expérience. Préparer la solution H-B-S-S-H-S-A pour la séparation des neutrophiles. Prélever le HBSS contenant du chlorure de calcium à l'aide d'une pipette et le transférer dans un flacon.

Aspirez l'HSA dans la seringue. Évitez de piéger des bulles d'air. Retirez l'aiguille de la seringue et remplacez-la par le filtre.

Injectez l'HSA à travers un filtre dans un flacon d'HBSS et vortexez pour mélanger lorsque vos autres matériaux sont prêts et à température ambiante ; prélèvez environ 15 millilitres de sang total. Cela permet d'obtenir entre 10 et 15 millilitres de neutrophiles à 10⁸. Le donneur ne doit pas avoir consommé d'alcool ni de médicaments sans ordonnance dans les 24 heures précédant le don d'échantillon sanguin.

Ces éléments peuvent perturber le processus de séparation. Le sang total peut être anticoagulé avec du citrate d'EDTA ou de l'héparine en ajoutant neuf parties de sang à une partie de citrate de sodium K3 EDTA ou à de l'héparine, selon les instructions du fabricant. Les étapes suivantes seront décrites dans cette procédure.

Séparez et retirez le plasma et les monocytes. Séparez et récupérez une couche de neutrophiles en lysant les globules rouges afin d'obtenir des neutrophiles en suspension libre lors de la première séparation. Récupérez les neutrophiles dans la couche de NIM.

Prélevez cinq millilitres de milieu d'isolement dans un tube d'essai. Placer le milieu d'isolement plus bas dans le tube permet qu'il agisse comme un filtre, car la centrifugation forcera le sang à traverser celui-ci soigneusement. Superposez délicatement cinq millilitres de sang au-dessus du NIM pour une séparation propre.

Veillez très attentivement à éviter de mélanger les solutions. Effectuez cette étape lentement et prudemment, avec la pointe de votre pipette proche de la surface du milieu de résolution, afin d'empêcher le mélange centrifuge. La solution à 500 RCF pendant 35 minutes.

À 20 à 25 degrés Celsius, le sang doit se séparer en six bandes distinctes. Ces six bandes sont le plasma, les monocytes, le milieu d'isolement, les neutrophiles, un autre milieu d'isolement, et le culot de globules rouges au fond. Si ces six bandes ne sont pas nettes et bien définies, le processus de séparation n’a pas été effectué correctement et devra être répété.

Les causes fréquentes d'une mauvaise séparation incluent un milieu d'isolement provenant d'un donneur ayant consommé de l'alcool au cours des 72 dernières heures ou ayant pris d'autres médicaments tels que le Tylenol ou l'aspirine. Retirer soigneusement et jeter le plasma, les monocytes et le milieu d'isolement. Placer ces couches dans un tube hermétique et jeter soigneusement, puis prélever à la pipette la couche de neutrophiles et tout le milieu d'isolement situé sous les neutrophiles, et les transférer dans un tube de centrifugeuse propre afin de récupérer le plus grand nombre possible de neutrophiles.

Il est souvent plus facile d'inclure également une partie du milieu d'isolement provenant de la couche inférieure. Ne pas perturber le culot au fond. Deuxième étape : affiner la couche de neutrophiles.

Diluez la solution de neutrophiles à 10 millilitres avec du HBSS sans calcium. Retournez le tube plusieurs fois pour suspendre les cellules centrifugées. La solution de neutrophiles.

350 g pendant 10 minutes. À une température de 20 à 25 degrés Celsius, un culot rouge doit être visible au fond du tube contenant les neutrophiles et les globules rouges résiduels. Retirer le surnageant à l’aide de la pipette.

Attention à ne pas perturber le culot au fond. Lyse des globules rouges.

Les globules rouges présents dans l'échantillon doivent maintenant être détruits par lyse. Pour lyser les globules rouges résiduels, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse des cellules rouges dans le tube pour resuspendre. Suspendez le culot en vortexant le tube à un réglage de trois à quatre.

Évitez d'augmenter le réglage du vortex au-dessus de quatre, car cela pourrait entraîner l'activation des neutrophiles. Il peut être nécessaire de faire tourner au vortex pendant plusieurs secondes ou d'effectuer des impulsions courtes pour dissoudre le culot. Centrifugez la solution de lyse à 250 RCF pendant cinq minutes.

Utilisez l'option de démarrage doux pour minimiser les dommages causés à l'échantillon. Retirez le surnageant à l'aide d'une pipette. Répétez le processus de lyse.

Si nécessaire, pour libérer la suspension des neutrophiles, ajouter 500 microlitres de HBSS sans calcium dans chaque tube. Vortexer le culot à un réglage de trois à quatre, diluer à 10 millilitres avec du HPSS sans calcium et centrifuger les neutrophiles à 250 RCF pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant et le jeter.

Resuspendre le culot dans 250 microlitres de solution de HBSS avec HSA, deux fois 10 à la puissance six. Des neutrophiles par millilitre sont généralement recueillis.