Coloration protéines dans les gels

Dans une vidéo précédente intitulée Séparation électrophorétique des protéines, nous avons montré comment un mélange complexe de protéines pouvait être séparé par électrophorèse sur gel. Dans cette vidéo, nous allons vous présenter quatre méthodes différentes de coloration du gel permettant de visualiser l'emplacement des protéines dans le gel. Bonjour, je suis Sean Gallagher de UVP, en collaboration avec le Centre de protéomique de l'Institut des études supérieures KEG.

Aujourd'hui, je vais vous montrer plusieurs techniques permettant de visualiser les protéines après séparation par électrophorèse. Cela inclut la coloration bleu argent de Kamasi, le cyro orange et le cyro ruby. Commençons donc tout d'abord par le bleu Kamasi.

La détection des bandes protéiques dans un gel par la coloration au bleu de Kamasi repose sur la liaison non spécifique d'un colorant. Dans ce cas, le bleu brillant de Kamasi G deux 50. Dans cette méthode, les protéines séparées dans un gel de polyacrylamide sont lavées à l'eau de haute pureté.

La localisation des protéines est ensuite détectée à l'aide d'une coloration bleue au kamasi à base d'eau. La limite de détection est de 0,3 à un microgramme par bande protéique. Pour commencer, partez d'un gel de polyacrylamide dans lequel les protéines ont été séparées par électrophorèse.

Tout en agitant doucement, placer le gel de polyacrylamide dans un récipient en plastique contenant 300 millilitres d'eau de haute pureté. Laisser reposer cinq minutes. Jeter l'eau et répéter deux fois supplémentaires après le troisième lavage.

Versez l'eau et recouvrez le gel de solution de coloration au bleu Kamasi pendant une heure, en agitant doucement. Après une heure de coloration, versez la solution de coloration. Rincez brièvement le gel en le plaçant dans environ 200 millilitres d'eau pendant 30 minutes. À ce stade, le gel peut être conservé dans l'eau en vue d'une imagerie ultérieure.

Le gel peut également être séché à ce stade afin de conserver un enregistrement permanent du gel. Pour ce faire, placez le gel sur deux feuilles de papier filtre Whatman de 3 mm et recouvrez le dessus d'un film plastique. Ensuite, séchez dans un appareil conventionnel de séchage des gels pendant une à deux heures à environ 80 degrés Celsius.

Une autre méthode de coloration des protéines est la coloration argentique, que nous allons démontrer ensuite. Bien que la méthode de coloration au bleu de Kamasi soit plus simple et plus rapide, la coloration argentique est nettement plus sensible, avec une limite de détection de 0,3 nanogramme de BSA. La détection de bandes protéiques dans un gel par coloration argentique dépend de la liaison de l'argent à divers groupes chimiques présents dans les protéines.

Le protocole suivant est basé sur le kit de coloration argent Silver Quest d'Invitrogen. Ce protocole dérive du protocole de coloration rapide, d'une durée d'environ 30 minutes, et représente l'une des nombreuses chimies fondées sur des kits utilisées pour la coloration argent compatible avec la spectrométrie de masse. Dans ce cas, nous utiliserons un gel mini préfabriqué d'Invitrogen avant de commencer la coloration argent.

Veillez à porter des gants en tout temps afin d'éviter toute contamination par des empreintes digitales. Placez le gel dans un récipient adapté au four à micro-ondes contenant 100 millilitres d'eau de qualité réactif. Rincez brièvement, puis versez l'eau.

Ensuite, ajoutez 100 millilitres de fixatif, composé d'éthanol à 40 %, d'acide acétique à 10 % dans de l'eau de haute pureté, et passez au four à micro-ondes pendant 30 secondes. Le traitement au micro-ondes réduit la durée des étapes d'incubation nécessaires en accélérant la liaison et la coloration. À ce stade, placez le gel sur un agitateur et agitez doucement pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, versez le fixateur, ajoutez 100 millilitres d'éthanol à 30 % pour laver le gel, passez au four à micro-ondes pendant 30 secondes, puis placez le gel sur un agitateur pendant cinq minutes. Après cinq minutes, éliminez l'éthanol. Ajoutez maintenant 100 millilitres de réactif sensibilisant, passez au four à micro-ondes pendant 30 secondes, puis placez sur un agitateur pendant deux minutes.

Après deux minutes, versez le réactif sensibilisant. Ajoutez 100 millilitres d'eau de qualité réactif, passez au four à micro-ondes pendant 30 secondes, puis placez sur un agitateur pendant deux minutes. Versez et répétez afin d'effectuer un total de deux cycles de lavage.

Ajoutez maintenant 100 millilitres de solution de coloration, passez au micro-ondes pendant 30 secondes, puis agitez doucement pendant cinq minutes. Au terme de ces cinq minutes, versez la solution de coloration. Ajoutez 100 millilitres d’eau de qualité réactif, ne passez pas au micro-ondes, interrompez cette étape et placez directement sur un agitateur pendant 20 à 60 secondes.

Jetez l'eau et ajoutez immédiatement 100 millilitres de la solution de développement, puis laissez développer jusqu'à ce que les bandes protéiques deviennent visibles. Lorsque le fond reste clair, cela prendra environ cinq à dix minutes. À ce stade, ajoutez 10 millilitres de solution d'arrêt au révélateur pour interrompre le développement et obtenir les meilleurs résultats.

Prenez une photographie du gel dès que possible, car il peut y avoir de légères variations de l'intensité de la couleur et une augmentation des éléments de fond non spécifiques. Avec le temps, le gel que vous observez contient des protéines résiduelles. Après le transfert électrophorétique, séchez le gel afin de conserver un enregistrement permanent ou rangez-le dans un sac en plastique refermable. Ensuite, nous démontrons une méthode de coloration fluorescente des gels.

Les colorants fluorescents présentent plusieurs avantages par rapport aux colorations protéiques traditionnelles. Les colorations pour gélose de protéines au cipro orange, que nous décrirons ici, peuvent détecter de un à deux nanogrammes de protéine par bande. Cette sensibilité est supérieure à celle de la coloration au bleu brillant de Kamasi et équivalente à celle de nombreuses méthodes de coloration argentique.

La coloration fluorescente est simple, nécessite moins d'intervention manuelle que les protocoles classiques de coloration argent et est terminée en moins d'une heure. Les protéines colorées peuvent être visualisées à l'aide d'un transilluminateur UV standard de 300 nanomètres ou d'un scanner laser. Dans ce cas, nous utiliserons à nouveau un gel miniprêt In Vitrogen pour préparer et séparer les protéines par électrophorèse SDS-PAGE.

Mais utilisez du SDS à 0,05 % dans le tampon de migration au lieu du SDS à 0,1 % habituel afin de réduire la fluorescence de fond. Pour commencer la procédure de coloration, versez la solution de coloration fluorescente cipro dans une petite boîte en plastique destinée à un ou deux gels mini de taille standard. Utilisez environ 50 millilitres de solution de coloration.

Il est important de noter que les boîtes de coloration doivent être nettoyées et rincées soigneusement avant utilisation, car tout détergent interférerait avec la coloration. Placez maintenant le gel dans la solution de coloration. Recouvrez le récipient de papier d'aluminium pour protéger le colorant de la lumière vive.

Agiter doucement le gel à température ambiante pendant 40 à 60 minutes. Éliminer la solution de coloration, puis rincer le gel moins d'une minute avec de l'acide acétique à 7,5 %, environ 100 millilitres, afin d'éliminer l'excès de colorant de la surface du gel. Retenir le gel en l'incubant toute la nuit dans du Tween 20 à 0,1 % pour visualiser et photographier les bandes protéiques. Placer directement le gel marqué de façon fluorescente sur un transilluminateur standard de 300 nanomètres ou sur un transilluminateur à lumière bleue.

Ensuite, nous allons démontrer une méthode alternative de coloration fluorescente, utilisant le colorant fluorescent Cipro ruby. La méthode de coloration au Cipro ruby a été spécialement conçue pour être utilisée en électrophorèse bidimensionnelle, mais s'est révélée être la coloration de gel la plus sensible pour les protéines en électrophorèse standard monodimensionnelle SDS-PAGE. Commencez par transférer le gel dans un récipient propre en polypropylène ou en PVC de taille appropriée.

Incubez le gel dans la quantité appropriée de colorant pour gel de protéines Cipro Ruby non dilué, avec une agitation douce continue sur un agitateur orbital à 50 tr/min. Couvrez le gel et incubez-le pendant au moins trois heures. Transférez le gel dans un récipient de coloration propre et rincez-le une fois dans une solution contenant 10 % de méthanol et 7 % d'acide acétique, récupérez-le, puis replacez le gel sur l'agitateurs pendant 30 minutes.

Afin de réduire la fluorescence de fond et d'augmenter la sensibilité, le gel est désormais prêt à être observé et photographié. Je tiens à vous remercier d'avoir suivi les protocoles d'aujourd'hui. Nous vous avons montré plusieurs procédures différentes pour visualiser les protéines après électrophorèse.

Certains sont très sensibles, comme la coloration fluorescente et la coloration argent, et d'autres sont courants, comme la coloration au bleu de kamasi. Il est important de se rappeler que la pureté des réactifs est essentielle. L'utilisation d'eau ultra-pure est également très importante, tout comme le respect du temps pour chacune des étapes.

Vous devez y prêter une attention particulière afin d'obtenir également des résultats reproductibles. Voilà, et bonne chance dans votre prochaine série d'expériences.