Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Sea elegance est un organisme modèle incroyablement utile en raison de nos connaissances sur ses lignées cellulaires ainsi que de l'abondance d'informations obtenues grâce au séquençage et à l'analyse de son génome entier. Dans cette vidéo, nous démontrons le processus d'injection microscopique de plasmides dans sea elegance et la sélection de descendants transgéniques à l'aide de la microscopie à fluorescence. En tant qu'animal transparent et multicellulaire, sea elegance est idéal pour visualiser in vivo des transgènes exprimant des protéines marquées par un fluorochrome. Bonjour, je m'appelle Laura Berkowitz et je suis chercheuse associée au laboratoire Caldwell, au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Alabama.

Et je suis Adam Knight, également du laboratoire Calwell à l'Université de l'Alabama. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer et réaliser une microinjection de plasmine afin de produire des *C. elegans* transgéniques, et je vous montrerai également comment sélectionner et maintenir des lignées de *C. elegans* transgéniques. Commençons.

Avant de commencer la microinjection, nous devons effectuer quelques étapes de préparation, que je vais vous montrer maintenant. Tout d'abord, préparez l'ADN plasmidique à injecter : deux plasmides sont nécessaires, l'un codant pour l'expression tissu-spécifique de notre gène d'intérêt, et le second fournissant un marqueur de transformation sélectionnable. Mélangez les plasmides ensemble dans un rapport un pour un de 50 nanogrammes par microlitre.

À chaque fois, préparez des plaques à vis, qui seront utilisées pour immobiliser les vers en vue de l'injection. Pour fabriquer les plaques à vis, placez d'abord plusieurs lamelles de 22 par 50 millimètres sur le plan de travail. À l’aide d’une pipette Pasteur, déposez une goutte d’agarose fondue à 2 % sur une lamelle, puis placez immédiatement une seconde lamelle par-dessus la goutte, à un angle de 90 degrés par rapport à la première.

Laisser la couche aéro se solidifier pendant quelques secondes, puis retirer le verre de couverture supérieur. Le diamètre du disque aplati doit être compris entre 15 et 20 millimètres. Comme pour une culture, laisser sécher complètement la lame à l'air libre pendant plusieurs heures ou toute une nuit.

Une fois secs, conserver les pastilles dans une boîte en verre couvercle à température ambiante. Ensuite, préparer les chargeurs d'aiguille pour la solution d'ADN. Pour ce faire, prendre un tube capillaire de cent microlitres et le chauffer au milieu d'une flamme nue, puis le tirer rapidement jusqu'à environ deux fois sa longueur.

Une fois que le tube capillaire est refroidi, séparez les deux moitiés d'un coup sec. Stockez 10 à 20 chargeurs d'aiguille pour l'injection. Vous pouvez les conserver verticalement dans un tube de microcentrifugeuse.

Brack, faites attention. Les pointes du chargeur d'aiguilles sont très tranchantes. Préparez maintenant les aiguilles de micro-injection.

Ces aiguilles sont fabriquées à partir d'un tube capillaire spécial contenant un filament de verre interne. Ce filament sert de mèche pour la solution d'ADN. Pour fabriquer les aiguilles, nous utilisons un appareil Niki PP eight 30 Polar avec un réglage de température de 24,8 ; plusieurs aiguilles sont tirées simultanément afin d'être stockées.

Plusieurs aiguilles peuvent être montées sur une bande d'argile à modeler. De petits éclats de lame de couverture seront utilisés pour ouvrir la pointe de l'aiguille étirée. Ces éclats sont préparés en enveloppant une lame de couverture de 18 sur 18 millimètres dans un essuie-tout Kim et en appliquant délicatement une pression jusqu'à ce qu'elle se brise en plusieurs morceaux.

Utilisez des fragments d'environ trois sur quatre millimètres de taille. En plus de préparer l'ADN et les aiguilles, préparez environ 50 à 100 vers sauvages correctement stagés pour chaque construction de vecteur d'expression à injecter.

Nous sommes maintenant prêts à installer le microscope de microinjection. Pour commencer l'installation du microscope, ouvrez la vanne principale du réservoir d'hélium relié au bras et au support de l'aiguille de microinjection. Fermez le régulateur pour permettre au gaz d'entrer dans la conduite.

En portant la pression à 35 PSI, le gaz peut être libéré à l’aide d’une pédale. Ensuite, insérez un chargeur d’aiguille dans un tube de pipette buccale standard et déposez une petite quantité du mélange de plasmide, environ un microlitre. Insérez maintenant délicatement le chargeur entièrement à travers l’aiguille de microinjection jusqu’à ce qu’une résistance soit ressentie.

Expulsez la solution d'ADN en soufflant doucement, puis retirez le chargeur. Une fois l'ADN chargé, insérez l'aiguille dans le bras de microinjection, en prenant soin de la placer à l'intérieur du petit joint en caoutchouc interne, puis fixez-la au bras du manipulateur. Placez ensuite un éclat de verre de couverture servant à casser les aiguilles sur un bord du tampon de vis sans fin.

Couvrez le fragment ainsi que toute la surface du coussinet de forage avec de l'huile de carbone creuse. Ensuite, placez le coussinet de forage sur la platine d'un microscope inversé. Une fois le coussinet de forage en place, positionnez l'aiguille au centre du champ de vision à l'aide de l'objectif Forex et d'un éclairage en champ clair, mais ne l'abaissez pas encore dans l'huile.

Positionnez ensuite le bord interne du fragment de lame couvre-objet au centre, puis faites la mise au point dessus. Abaissez l'aiguille dans l'huile, en la plaçant dans le même plan focal que le fragment de lame couvre-objet. Augmentez le grossissement en passant à l'objectif 40 x, puis refaites la mise au point sur le bord du fragment et repositionnez la pointe de l'aiguille si nécessaire.

Brisez maintenant l'extrémité de l'aiguille d'injection. Pousser délicatement l'aiguille contre le bord du fragment de lame de verre, tout en appliquant simultanément une courte impulsion de gaz à l'aide de la pédale. L'aiguille sera suffisamment ouverte.

Lorsque de petites gouttelettes de liquide s'échappent de l'extrémité de l'aiguille en raison d'un écoulement excessif dû à une ouverture trop grande, cela n'est pas souhaitable car cela tuerait les animaux. Une fois l'aiguille prête, nous commençons la microinjection. Ensuite, retirez le tampon poussoir de la platine en soulevant l'aiguille.

Mais ne modifiez pas la position des axes X ou Y. Faites glisser la platine hors de sous l'aiguille. Retirez le tampon de la vis sans fin et placez-le sur un microscope stéréo.

Transférez un ver sur le tampon situé sous la surface de l'huile. Si le ver se tortille, caressez-le doucement jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le tampon de prélèvement ; le ver humide doit adhérer au tampon sec. Replacez rapidement le tampon de prélèvement sur la platine, en centrant le ver dans le champ de vision.

Abaissez ensuite l'aiguille jusqu'au même plan de focalisation que le ver. Basculez les filtres du microscope inversé sur l'éclairage Hoffman. Ce filtre de contraste permet de rendre visibles les détails morphologiques du ver.

À l’aide de l’objectif 40 x, focalisez sur le centre sensoriel granuleux du gonade du vers situé sous le motif en nid d’abeille des noyaux germinatifs. Choisissez le gonade qui se trouve du côté du vers orienté vers l’aiguille. Réglez précisément la position de l’aiguille jusqu’à ce que la pointe soit également au point.

Insérez délicatement l'aiguille au centre du gonade et appliquez une brève impulsion de pression gazeuse pour expulser une ou deux gouttelettes d'ADN dans le bras du gonade. Avec beaucoup d'entraînement et d'habileté, vous devriez observer une onde liquide se propager à travers le gonade distal. Vous pouvez atteindre le centre du gonade à chaque fois.

Gardez à l'esprit qu'il est important de travailler rapidement lors de l'injection d'un ver, car il peut facilement se dessécher. L'ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de une à deux minutes.

Une fois l'injection terminée, retirez le coussin de la vis sans fin du plateau et placez-le sous un microscope stéréo. Appliquez un microlitre de tampon M neuf directement sur le ver injecté. Cela peut nécessiter d'immerger la pointe de la pipette sous la surface de l'huile halo carb.

Le tampon doit réhydrater le ver, qui flottera ensuite à la surface du tampon aérosol ; transférez le ver sur une plaque ordinaire à l’aide d’un curet. Je vais maintenant remettre les vers injectés à Adam, qui nous montrera le processus de sélection et de maintien des lignées transgéniques. Les vers injectés sont transférés individuellement sur des plaques fraîches de 60 millimètres ensemencées et laissés à se reproduire.

Ces vers représentent la génération P zéro. Généralement, les animaux injectés sont incubés à 20 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu'à l'apparition de la descendance. Une fois la descendance apparue, nous pouvons commencer le criblage des vers transgéniques.

Les descendants F1 sont observés afin de détecter la présence du marqueur transgénique. Dans ce cas, le marqueur sélectionnable est fluorescent, ce qui permet de réaliser un criblage à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence. Chaque animal porteur du marqueur fluorescent de la génération F1 est cloné individuellement sur une nouvelle boîte.

Le P zéro injecté peut produire seulement un à cinq descendants fluorescents parmi tous ses F1. Laisser les hermaphrodites F1 se reproduire à 20 degrés pendant deux à trois jours jusqu'à l'apparition des descendants. Une fois la génération F2 prête, on observe également la présence d'animaux transgéniques. Les animaux F2 ayant hérité et exprimé un marqueur transgénique sont considérés comme une lignée stable.

Chaque lignée stable indépendante doit être maintenue comme une lignée distincte ; propager chaque lignée en transférant plusieurs animaux transgéniques sur une nouvelle boîte à chaque génération. Cette opération doit être effectuée à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence. Si le marqueur sélectionnable est fluorescent, afin de contrôler la variabilité du nombre de copies du gène, générer un minimum de trois lignées stables indépendantes par construct injecté.

Nous venons de vous montrer comment réaliser une microinjection de constructions vectorielles d'expression et observer elgan, ainsi que sélectionner des lignées stables. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.