Le dépistage de l'agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose

Bonjour, je suis Randall Hoffman, étudiant diplômé du laboratoire de Susan Linus au département de biologie du MIT. Aujourd'hui, je vais vous présenter la technique de rétroélectrophorèse sur gel en présence de détergent semi-dénaturant, ou SDD AGE. Notre laboratoire utilise cette méthode pour dépister les prions et d'autres protéines allégéniques.

Notre version de l'âge SDD est simple et fiable, et peut être adaptée pour traiter un nombre quelconque d'échantillons. Les amyloïdes sont exceptionnellement résistants à la dénaturation par le SDS, ce qui permet de les séparer des autres protéines à l'aide de la SDDH. Toutefois, les données obtenues par SDDH ne peuvent pas à elles seules être utilisées pour confirmer qu'une structure est un amyloïde.

Pour ce faire, vous devez utiliser d'autres techniques. Dans cette optique, permettez-moi de vous montrer. Le S-D-D-H-S-D-D-H peut être réalisé à l'aide d'un équipement standard pour l'électrophorèse horizontale de l'ADN.

Tout d'abord, vous devez assembler le bac de coulée du gel. La taille de l'appareil dépendra du nombre d'échantillons que vous possédez. Pour un grand nombre d'échantillons, nous utilisons une plaque de 20 sur 24 centimètres et jusqu'à quatre peignes de 50 puits.

Pour préparer le gel, vous aurez besoin d'agarose à faible EEO de force moyenne ou élevée, d'un tampon 1X TAE et d'une solution mère de SDS à 10 %. Préparez une solution d'agarose à 1,5 % et du tampon 1X TAE. Vous voudrez fabriquer un gel aussi épais que possible afin de pouvoir charger le plus d'échantillon possible et maximiser la détection. Chauffez le mélange au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.

Ajoutez rapidement le stock de SDS 100 X à 0,1 % et tourbillonnez pour homogénéiser. Si un dépôt d'agarose se forme pendant cette étape, réchauffez et dissolvez-le sur un bloc chauffant. Prenez garde de ne pas laisser bouillir.

Après avoir ajouté le SDS, la solution risquant de mousser facilement, versez-la dans le bac de coulée tant qu'elle est encore chaude. Utilisez ensuite un peigne pour éliminer les bulles d'air qui pourraient ultérieurement gêner le transfert sur gel. Une fois que le gel est complètement refroidi et solidifié, retirez soigneusement les peignes et placez le gel dans la cuve.

Immergez complètement le gel dans un tampon XTAE contenant 0,1 % de SDS. Vous êtes maintenant prêt à charger vos échantillons. Les échantillons protéiques utilisés dans le SDDH sont préparés de la même manière que dans un SDS-PAGE, à deux exceptions importantes près.

Tout d'abord, vous devez éviter de chauffer les échantillons, ce qui pourrait dénaturer les agrégats en monomères protéiques. Deuxièmement, veillez à prévenir la dégradation des protéines. Étant donné que les conditions dénaturantes utilisées ici ne sont pas suffisantes pour inactiver toutes les protéases, nous recommandons d'utiliser une concentration d'au moins deux fois supérieure à la concentration recommandée d'un cocktail complet d'inhibiteurs de protéases.

Dans cette démonstration, nous utiliserons des lysats de cellules de levure qui surexpriment une protéine d'intérêt particulière. Nous utilisons généralement deux millilitres de culture. Les cultures sont cultivées dans des blocs de 96 puits disponibles chez VWR, mais lors de l'analyse de protéines peu abondantes, des volumes de culture plus importants doivent être utilisés.

Récupérez les cellules par centrifugation de la culture à 2000 RCF pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, retirez le surnageant et lavez les cellules en les resuspendant dans de l'eau, puis centrifugez à nouveau. Après la deuxième centrifugation, retirez le surnageñant et resuspendez les cellules dans une solution de plaquage fraîche. Les enzymes présentes dans la solution digèrent les parois cellulaires, ce qui permet de lyser efficacement les cellules avec un petit volume de tampon de lyse. Incubez pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.

Centrifuger les cellules plastiques supplémentaires cette fois à 800 RCF pendant cinq minutes. Éliminer complètement le surnageant et resuspendre chaque culot dans 100 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, recouvrir le bloc avec du ruban adhésif et vortexer à grande vitesse pendant deux minutes.

Cela permet à tous les plastiques de sphère de LY P d’éliminer les débris cellulaires à 4 000 ×g pendant deux minutes. Transférez soigneusement le surnageant sur une plaque PCR de 96 puits.

Typiquement, nous analysons des centaines d'échantillons à la fois dans notre laboratoire, c'est pourquoi nous utilisons un système de manipulation de liquides. Si désiré, déterminez la concentration en protéines des lysats. Ensuite, ajoutez un tampon d'échantillonnage 4 x aux échantillons afin d'obtenir des lysats contenant un tampon d'échantillonnage 1 x, puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante.

Chargez maintenant les échantillons dans le gel. Si souhaité, conservez la moitié des échantillons pour une analyse par électrophorèse SDS-PAGE. Chargez également des marqueurs de poids moléculaire, y compris des marqueurs pré-étiquetés et un marqueur de très haut poids moléculaire, tel que l'extrait de fibrine de poulet.

Si nécessaire, il est important de maintenir le gel au frais afin d'éviter la diffusion des protéines de faible masse moléculaire ; vous pouvez donc choisir de faire la migration dans une chambre froide. Faites migrer le gel à basse tension, inférieure à trois volts par centimètre de longueur du gel. Faites migrer le gel pendant plusieurs heures jusqu'à ce que le front de migration atteigne environ un centimètre de l'extrémité du gel.

Étant donné que l'amyloïde n'est pas dénaturé par le SDS à 2 % à température ambiante, il restera intact tandis que d'autres complexes, notamment la plupart des agrégats non amyloïdes, se dissocieront en présence de SDS à 2 %. Ainsi, la majorité des protéines seront sous forme monomérique et migreront rapidement à travers le gel. En revanche, les amyloïdes de haut poids moléculaire résistants au SDS migreront plus lentement.

À ce stade, le gel sera prêt pour le transfert. Bien que plusieurs méthodes de transfert puissent être utilisées, nous obtenons les meilleurs résultats avec le transfert capillaire. Étant donné que le transfert capillaire peut s'adapter à n'importe quelle taille de gel, il est pratique d'analyser des centaines d'échantillons par transfert capillaire.

Une pile de papiers buvards secs sert à faire passer le tampon à travers le gel, déposant ainsi les protéines sur une membrane de nitrocellulose placée entre les papiers et le gel. Vous devrez découper un morceau de nitrocellulose, comme du High Bond C, supplémentaire, aux mêmes dimensions que le gel. Vous devrez également découper 20 morceaux de papier buvard GBO oh quatre et huit morceaux de papier buvard GBO oh deux aux mêmes dimensions que le gel.

Le GB oh four est très épais et absorbant. Le GBO oh deux est en revanche beaucoup plus mince et possède une texture plus fine, ce qui assure un contact plus uniforme avec la membrane. Découpez un morceau supplémentaire de GBO oh quatre à utiliser comme mèche, en le rendant environ 20 centimètres plus large que le gel immergé.

Le WIC UL nitreux et quatre morceaux de GBO oh deux et un XTBS dans un contenant en plastique assemblent une pile de feuilles comme suit : 20 morceaux de GBO oh quatre secs. Puis quatre morceaux de GBO oh deux secs. Puis un morceau de GBO oh deux préhumidifié.

Placez la nitrocellulose sur le dessus de ce bloc. Rincez brièvement le gel sur le plateau de coulée à l’eau pour éliminer l’excès de tampon de migration. Ensuite, commencez soigneusement à faire glisser le gel hors du plateau sur le bloc, tout en ajoutant du TBS sur le gel au fur et à mesure qu’il quitte le plateau vers la membrane, si nécessaire.

Le tampon supplémentaire aide à empêcher les bulles de s'immobiliser dans le gel. La pipette de transfert convient bien à cet usage une fois que le gel a été entièrement déplacé vers l'empilement. Vérifiez soigneusement la présence de bulles, s'il y en a.

Soulevez le bord du gel et réappliquez du tampon jusqu’à ce que les bulles soient éliminées. Placez les trois morceaux restants de GBO oh deux préhumidifiés sur le dessus du gel. Assurez un contact complet entre toutes les couches en roulant fermement une pipette sur le dessus de l’empilement.

Encadrez la pile de transfert avec deux plateaux surélevés contenant du TBS ; étendez le tampon pré-humidifié sur la pile de manière à ce que chaque extrémité du tampon soit immergée. Recouvrez la pile de transfert assemblée avec un plateau en plastique supplémentaire portant un poids supplémentaire, comme une bouteille d'eau de 500 ml. Le tampon capillera le tampon des plateaux et les papiers de transfert secs capillèreront le tampon à travers le gel sur plusieurs heures.

Cela déposera les protéines sur la membrane ; laissez le transfert s'effectuer pendant au moins trois heures ou toute la nuit. Une fois le transfert capillaire terminé, la membrane peut être traitée selon la méthode classique du western blot. Voici un exemple typique de transfert de protéines surexprimées dans une souche de levure qui prédispose certaines protéines à former des amyloïdes.

Vous pouvez clairement voir que certains de nos candidats forment très bien des espèces amyloïdes ou de haut poids moléculaire résistantes au SDS, comme celles illustrées ici et ici. D'autres, en revanche, ne forment pas d'agrégats et sont entièrement monomériques, comme celles-ci et celles-ci. De plus, vous pouvez observer que la taille des polymères amyloïdes varie selon la protéine, ce que vous pouvez constater dans ces deux bandes.

Nous venons de vous présenter une méthode simple pour analyser les agrégats de haut poids moléculaire et insolubles, tels que les amyloïdes de prions candidats. Nous espérons que vous avez apprécié cette présentation et que cette technique vous sera utile dans l'étude des protéines amyloïdes immunogènes. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos recherches.