Les protocoles de micro-applicateur assistée Infection des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Bien que le virus baculovirus spécifique aux arthropodes soit utilisé comme outil de recherche standard pour les systèmes d'expression de protéines eucaryotes, il est également en cours de développement comme agent insecticide écologiquement sûr, capable de tuer des insectes phytophages tels que les lépidoptères dans la nature. Les larves de lépidoptères sont infectées par les baculovirus lorsqu'elles consomment du feuillage infecté. Les larves ou chenilles ingèrent le baculovirus sous une forme appelée polyèdre, qui correspond à un complexe de particules virales emballées dans une grande structure protéique cristalline protégeant le virus contre la dessiccation.

Une fois que la larve est infectée, le virus propagé répand l'infection à l'intérieur de l'insecte. Le virus s'approprie les mécanismes d'assemblage des acides nucléiques et de synthèse des protéines de l'hôte afin de produire davantage de virus et de polyèdres. Finalement, la larve devient tellement infectée par le virus qu'elle se dissout en un exsudat visqueux de polyèdres qui s'écoule sur les surfaces végétales consommées par l'insecte, et le cycle recommence alors afin de déterminer l'efficacité insecticide d'un Baculovirus particulier.

Les techniques de micro-application de la souche Avir et les bioessais peuvent être combinées. Les larves de Leid dorin peuvent être infectées par injection du virus butted directement dans l'hémolymphe ou la cavité corporelle, et les taux de mortalité peuvent être évalués. En outre, les larves peuvent être infectées avec des polyèdres à l'aide d'une injection assistée par micro-applicateur oral, et le moment de l'infection du tube digestif et d'autres tissus peut être analysé.

Bonjour, je suis Wendy Sparks au laboratoire de Brian e boning au Département d'entomologie de l'Université d'État de l'Iowa et je viens également de boning snap. Aujourd'hui, nous allons vous montrer deux procédures permettant d'infecter des drosophiles de laboratoire DI avec le virus backlog. Les deux méthodes utilisent un micro-applicateur.

Tout d'abord, je vais vous montrer comment utiliser un micro-applicateur pour délivrer le virus corporel dans le heni par le prolé. Ensuite, je vais vous montrer comment utiliser le micro-applicateur pour délivrer le polyadényle dans le milieu de garde par la souris. Commençons donc.

Lorsqu'ils sont conçus à des fins insecticides, les virus bâtonnets contiennent généralement le gène de la polyédrine afin de faciliter l'infection orale des larves de ravageurs. Toutefois, dans certains cas, il peut être justifié de tester un virus bâtonnet dépourvu de polyédrine pour évaluer ses effets insecticides potentiels ou pour contourner le tube digestif de l'insecte. Dans ce cas, une injection du virus pur au moyen d'un micro-applicateur peut être réalisée afin d'infecter les larves avant le début du test.

Le titre de la souche de travail du virus buté doit être déterminé à l'aide d'un dosage par plaques ou d'essais de dilution en point final. Pour les expériences physiologiques, des injections de cinq fois 10 à la puissance 4 PFU par cinquième stade larvaire H VNS seraient typiques. Pour commencer ce bioessai, charger chaque dilution du virus buté dans une seringue en plastique d'un cc munie d'une aiguille fine de calibre 28,5 ou 32.

En général, une à trois microlitres de solution virale fraîchement préparée, avec une titration de 10 puissance sept à 10 puissance huit par millilitre, peuvent être utilisés pour chaque larve, de sorte que le chargement de 300 à 500 microlitres dans la seringue est suffisant pour la plupart des applications. Ensuite, éliminer les bulles d'air de la seringue en la tenant verticalement afin de faire remonter l'air vers l'extrémité de l'aiguille et en expulsant le liquide.

Fixez ensuite la seringue sur le tube de support de seringue. Réglez maintenant le volume à 1,0 microlitre. Pour chaque gouttelette au niveau de l'unité de commande du microapplicateur, étalonnez d'abord l'unité de commande afin de garantir que le volume correct est délivré ; la vitesse de délivrance de la gouttelette peut être réglée sur une échelle de zéro à neuf.

Une plage allant de zéro à un est couramment utilisée. Appuyez sur la pédale pour vous assurer que la solution est dispensée correctement. N'oubliez pas que si trop de solution est dispensée ou si l'application est trop lente, les réglages de volume et de vitesse peuvent être ajustés jusqu'à ce que le volume approprié de solution soit appliqué au débit correct.

Je suis maintenant prêt à commencer l'injection pour l'infection par H VNS. Les larves de cinquième stade précoce sont généralement injectées, la taille plus grande des stades ultérieurs facilitant le processus d'injection. Insérez la pointe de l'aiguille à travers la plante d'une des pattes prothoraciques et dans la cavité corporelle.

Remarque : lorsque la pointe de l'aiguille pénètre dans le prole, modifier la position du corps de la larve afin d'éviter d'endommager l'intestin et la paroi corporelle. Appuyez alors quatre fois sur la pédale pour injecter quatre microlitres de solution virale dans l'hémocèle. Une fois les injections terminées, replacer toutes les larves dans l'incubateur à 28 degrés Celsius. Vérifier fréquemment la présence de larves mortes et s'assurer qu'une alimentation suffisante est disponible pour les larves survivantes.

Bien que les larves de derniers stades ne meurent pas d'une lésion de la cuticule résultant d'une injection, les larves doivent tout de même être examinées 24 heures après l'injection en cas de dommage au tube digestif, qui pourrait résulter d'une infection bactérienne. Cette mortalité précoce doit être exclue de l'analyse des données. Si l'on utilise le bioessai assisté par microapplicateur avec virus buté pour des essais de concentration létale, le bioessai doit être répété trois ou quatre fois à des occasions distinctes.

Utilisez 30 individus par dose pour chaque traitement viral ou contrôle. Utilisez un programme d'analyse probatoire approprié, tel que Polo ou SAS, pour calculer les valeurs de CL50, les intervalles de confiance à 95 % et les statistiques appropriées. Ce bioessai peut également être utilisé pour déterminer les valeurs de temps de survie ST50 après inoculation d'une dose fixe de virus.

Dans ce cas, la mortalité des larves est évaluée toutes les quatre à huit heures avec des observations plus fréquentes. Si le taux de mortalité est élevé, les temps médians de survie ainsi que les limites de confiance à 95 % sont calculés à l’aide de l’estimateur de Kaplan-Meier en utilisant un programme S-Plus ou SAS. Maintenant que Harran vous a montré le bioessai assisté par micro-application utilisant un virus buté.

Je vais vous montrer le test. L'inoculation orale de polyèdres directement dans l'intestin de l'insecte est utilisée lorsque le moment précis de l'infection est crucial. Par exemple, lorsqu'on surveille la manière dont le virus se dissémine à l'intérieur de l'insecte, commencez ce test en mettant en suspension les polyèdres dans une solution neutre flottante composée de trois parties de glycérine pour deux parties d'eau, allant de 10 à 300.

Les polyèdres pourraient être utilisés pour le stade larvaire de quatrième instar, par exemple. Ensuite, charger cette solution dans une seringue en plastique ou en verre d'un CC pour tuberculine, munie d'une aiguille émoussée de calibre 32. Placer la seringue sur le tube support du micro-applicateur en regardant à travers un microscope.

Prenez la larve étoilée au quatrième ou cinquième stade, insérez l'aiguille par la bouche jusqu'à la région antérieure du tube digestif moyen, puis administrez les polyèdres. Cette technique nécessite un certain entraînement. Tout d'abord, il peut être délicat de maintenir les larves avec des gants sans les écraser.

Deuxièmement, il faut un peu de pratique pour guider l'aiguille au-delà des pièces buccales. Nous vous recommandons de vous entraîner à inoculer environ 30 larves avec du PBS. Si vous percez accidentellement l'intestin, cela sera évident car les larves mélanisent et deviennent noires assez rapidement.

Encore une fois, comme l'inoculation orale assistée par micro-applicateur permet de connaître précisément le moment de l'infection, cette méthode est particulièrement utile pour les expériences où le moment de l'infection est crucial afin de déterminer comment le virus se propage au sein de l'insecte. Par exemple, des virus exprimant la bêta-galactosidase peuvent être inoculés par voie orale chez des larves, qui sont ensuite disséquées à différents intervalles de temps pour identifier les tissus infectés et le moment de cette infection. Nous allons simplement vous montrer deux vaisseaux utilisés pour l'infection assistée par micro-applicateur. L'insecte est infecté par le virus, le premier cas correspondant à une inoculation directe via le prothorax par un virus pulvérisé, ce qui permet de contourner la physiologie intestinale et d'évaluer la létalité ainsi que le délai létal du virus étudié.

La deuxième technique consistait en une inoculation directe dans l'intestin moyen à l'aide de polyèdres. Cela permet de délivrer une dose très précise directement dans l'intestin moyen, ainsi que de contrôler avec une grande précision le moment de l'événement. Vous pouvez alors étudier également la mortalité et d'autres phénotypes du virus.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les larves tuées par le virus baula des cadavres sont généralement fragiles et peuvent facilement rompre, libérant ainsi le virus. Il est donc essentiel de stériliser les surfaces de travail et de jeter les gants contaminés et les matériaux jetables de manière appropriée afin d'éviter toute contamination. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.