Réagréger cultures Thymus

Bonjour, je suis Andrea White et je travaille dans le laboratoire de Graham Anderson et Eric Jenkinson au Centre MRC pour la Régulation Immunitaire de l'Université de Birmingham. Aujourd'hui, je présente un protocole permettant d'obtenir des cultures organotypiques de thymus réagrégés, qui peuvent être utilisées pour étudier les interactions cellulaires complexes survenant durant la différenciation des lymphocytes T. Avant le début de cette procédure, des lobes thymiques embryonnaires ont été isolés et traités afin d'éliminer tous les lymphocytes.

Cela peut être observé sur une vidéo séparée. Les lobes alienoïdes sont ensuite dissociés afin de produire une préparation de cellules stromales. Enfin, les cellules sont regroupées pour former une culture organotypique de réagrégat fmic.

Commençons. Après cinq à sept jours de culture, les LO devraient être prêts à être dissociés pour préparer des cellules en suspension. Plongez les filtres de 0,8 micromètre dans une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640 supplémenté en 10 % de FCS. À l’aide de pinces, repoussez délicatement les pentes de fibres qui ne flottent pas. Utilisez une pipette de 1 ml pour transférer les lobes dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.

Nous recommandons de ne pas dépasser 50 lobules par tube Eppendorf. Laisser les lobules se déposer au fond du tube par gravité unitaire et éliminer le milieu. Laver les lobules avec un millilitre de PBS, puis laisser les lobules redescendre au fond du tube.

Répétez cela pour un total de trois lavages au PBS, retirez le dernier lavage au PBS et ajoutez 600 microlitres d'une solution de tripsine 0,25 %. Placez le tube Eppendorf dans une étuve à 37 degrés pendant 25 minutes. Triturez délicatement les lobes à l’aide d’une pipette munie d’une pointe bleue de 1 ml pendant 10 secondes, puis remettez le tube dans l’étuve ; après 20 minutes, pipetez les lobes vers le haut et vers le bas afin de les dissocier complètement.

Il devrait falloir environ 30 secondes pour obtenir une suspension monocellulaire. Ajoutez 400 microlitres de RPMI 1640 glacé contenant 10 % de FCS afin de neutraliser la trypsine. Précipitez les cellules par centrifugation à 1 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C, éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans 1 ml de RPMI 1640 contenant 10 % de FCS si désiré. Dénombrer les cellules.

Typiquement, nous nous attendrions à environ 50 000 cellules par lobe de dioxazine, à partir d'un tissu fibreux E15. Nous sommes maintenant prêts à former les cultures agrégées de fmic Corgan dans un tube d'orph de un millilitre et demi. Cellules stromales fines, mélangées et fraîchement préparées.

Avec les fibrocytes pré-sélectionnés CD4 positifs CD8 positifs. Nous recommandons un rapport d'environ un pour un entre les cellules stromales et les fibrocytes. Le nombre de cellules que vous utiliserez dépendra du nombre de cellules disponibles et des expériences à réaliser.

Nous recommandons au moins cent mille cellules au total et pas plus de 1,5 million de cellules. Vous souhaitez que les agrégats V soient suffisamment grands pour être reproductibles, mais pas trop grands au point que le centre meure. Faites tomber les cellules en culot par centrifugation à mille tr/min pendant 10 minutes. À quatre degrés C, assemblez soigneusement le filtre de culture d'organes.

Retirer toutes les a SUP natin dans l'étape avec un P 200 par pet. Vortexer le culot cellulaire pendant 10 secondes pour former une suspension. Le volume doit être d'environ un à deux microlitres mouth.

Étaler la suspension en une fine couche, en maintenant la suspension de cellules à l'extrémité du dispositif. Sous notre microscope stéréoscopique, placer délicatement par aspiration la suspension cellulaire au centre d'un filtre de 0,8 micromètre. Idéalement, les cellules doivent être déposées sous forme d'une goutte dressée en un cercle d'un à deux millimètres de diamètre.

Si la suspension commence à s'étaler, laissez le liquide de la suspension s'écouler à travers le pos avant de déposer les cellules restantes. Placez la boîte dans une boîte plastique hermétique pour sandwich et fermez-la. Comme pour les cultures d'organes thymiques, placez une boîte dans une étuve ; les cultures forment des structures intactes dans les 18 heures suivant la mise en culture.

Après quatre à cinq jours de culture, ils généreront des sous-populations de cytes matures CD quatre positif huit négatif et CD quatre négatif huit positif. À partir de 50 lobes traités à la dioxazine, on devrait obtenir suffisamment de cellules stromales pour préparer de trois à cinq cultures réagrégées. Ces cultures apparaissent généralement sous forme de monticules cohérents de cellules qui peuvent être décollés des filtres à l’aide de pinces sans être endommagés.

Nous venons de décrire la méthode permettant d'étudier la sélection positive par les cellules épithéliales F. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier la sélection négative médiée par les cellules dendritiques. Enfin, en utilisant des fibrocytes transgéniques pour le TCR ou des cellules stromales déficientes en CMH de classe I ou en CMH de classe II.

Ce système permet des études séparées de la sélection des lymphocytes T CD quatre positifs ou des lymphocytes T CD huit positifs. Merci d'avoir suivi.