Immunoprécipitation ADN méthylé

Ce vidéo montre un protocole d'immunoprécipitation de l'ADN méthylé, ou MeDIP, une méthode utilisée pour isoler spécifiquement l'ADN méthylé de manière impartiale. La méthylation de l'ADN chez les mammifères est caractérisée par l'ajout d'un groupe méthyle en position C5 de la cytosine.

Lorsqu'elle est présente dans un dinucléotide CPG, il s'agit d'une marque épigénétique réversible qui joue un rôle important dans le développement normal, ainsi que dans plusieurs processus pathologiques. Les fonctions normales de la méthylation de l'ADN incluent l'inactivation du chromosome X chez les femmes, le silence des éléments répétitifs, l'empreinte génomique et le maintien de la stabilité génomique. La méthylation de l'ADN a également été mise en évidence dans de nombreuses maladies telles que le cancer, le syndrome de Prader-Willi, le syndrome de ICF (immunodéficience, instabilité centromérique et anomalies faciales) et d'autres syndromes.

Dans les cancers, par exemple, une hyperméthylation anormale des promoteurs peut entraîner la suppression de gènes essentiels de suppression tumorale. Tandis qu'une hypométhylation inappropriée provoque une instabilité chromosomique et l'activation des oncogènes, la réunion est réalisée en fragmentant d'abord l'ADN par sonication, en des morceaux dont la taille varie entre 300 et 1000 paires de bases. L'ADN soniqué est ensuite dénaturé à 95 degrés Celsius.

Des anticorps primaires, qui reconnaissent la méthazine en position cinq prime, sont ajoutés et laissés pour se lier aux fragments d'ADN méthylés. Des anticorps secondaires, conjugués à des billes magnétiques Dyna, sont utilisés pour isoler les fragments d'ADN qui ont été liés par l'anticorps primaire. Les fragments non méthylés sont éliminés et les anticorps sont digérés par la protéinase.

Le nettoyage au chloroforme phénylé de KA élimine les protéines digérées et la précipitation purifie l'ADN, qui est désormais enrichi en fragments méthylés. L'ADN peut ensuite être utilisé pour des applications telles que la PCR, les puces à ADN et le séquençage. Ce protocole est généralement réalisé en deux jours.

Le jour un comprend la préparation de l'ADN, la sonication, l'immunoprécipitation et la digestion des protéines. Le jour deux comprend l'extraction par phénol-chloroforme et la précipitation à l'éthanol afin de purifier et d'isoler l'ADN enrichi en méthylations. Plusieurs matériaux spéciaux sont nécessaires pour cette expérience, notamment des tubes centrifugeuses silanisés, un appareil de sonication de l'ADN, un anticorps primaire, un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine de souris, un anticorps secondaire, des billes Dyna conjuguées à l'anticorps anti-IgG de mouton, et un support magnétique pour tubes.

La première étape du protocole Meetup consiste en la préparation de l'ADN. Il est impératif d'évaluer la nature de l'ADN au préalable. Connaître l'état de l'ADN échantillon, qu'il soit principalement bicaténaire ou monocaténaire, est nécessaire, car une quantification précise de l'échantillon est d'une importance capitale, et diverses méthodes de détermination de la quantité d'ADN peuvent être négativement affectées par la présence d'espèces d'ADN indésirables.

La quantité d'ADN double brin peut être évaluée facilement par photométrie spectrale à l'aide d'un NanoDrop 3. Chargez 1,5 microlitre et réglez le type de mesure sur acide nucléique, sélectionnez ADN 50 comme paramètre de calcul, puis initialisez l'appareil avec 1,5 microlitre d'eau. Nettoyez les plateaux et effectuez le blanc avec 1,5 microlitre du liquide. L'échantillon est dissous dans le solvant : nettoyez les plateaux, chargez 1,5 microlitre de l'échantillon, puis appuyez sur mesurer.

La concentration sera indiquée et peut être utilisée. Pour calculer le nombre de microlitres nécessaire pour moi, plongez un A deux 60 à deux 80 avec un ratio de 1,8, ce qui est idéal ici. Un échantillon d'un microgramme est préparé.

Cependant, un échantillon aussi faible que 200 nanogrammes suffit pour obtenir des résultats concluants. Pour la réunion, chargez l'échantillon d'ADN dans un tube propre silanisé. Ajoutez suffisamment d'eau stérile pour ajuster le volume final à 50 microlitres.

La sonication de l'ADN et l'immunoprécipitation doivent être effectuées dans des tubes silanisés afin d'éviter la liaison non spécifique de l'ADN et des protéines aux parois des tubes. Une fois l'ADN préparé, l'échantillon doit être soumis à une sonication, qui est nécessaire pour fragmenter l'ADN, car l'immunoprécipitation est plus efficace avec des fragments d'ADN plus petits. Chargez l'échantillon dans le sonicateur, assurez-vous que le réglage de puissance est positionné sur « élevé » et que l'appareil est réglé sur 30 secondes. Après 30 secondes d'arrêt, remplissez le bac jusqu'au trait de remplissage avec de l'eau à quatre degrés Celsius.

Soniquez l'échantillon pendant sept minutes. Une fois la sonication terminée, retirez le tube et placez-le sur de la glace. Il est important d'optimiser les conditions de sonication en fonction de l'échantillon et de la taille de l'ADN prévus au préalable.

Par exemple, un échantillon d'ADN partiellement dégradé nécessitera un temps de sonication plus court. Les produits de sonication peuvent être visualisés par des techniques électrophorétiques classiques. À ce stade, on recherche des fragments d'ADN dont la taille varie entre 300 et 1000 paires de bases, destinés à une utilisation ultérieure.

Dans les tests par puces à ADN et par PCR, vous devez réserver un cinquième de votre ADN pour servir d'ADN témoin ou de référence ; dans ce cas, 800 nanogrammes d'ADN soniqué seront utilisés pour l'immunoprécipitation et le reste sera mis de côté comme ADN de référence. L'étape suivante du protocole consiste en la réaction d'immunoprécipitation (IP). Avant l'ajout de l'anticorps primaire, l'ADN doit être dénaturé. La dénaturation est nécessaire car l'anticorps primaire est sensible à l'ADN simple brin.

Placer l'échantillon dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois l'étape de dénaturation terminée, transférer immédiatement le tube sur de la glace pendant au moins cinq minutes. Cela empêchera l'ADN dénaturé de se replier et permettra une liaison optimale des anticorps lorsque l'échantillon aura refroidi.

Faites tourner brièvement le tube afin de rassembler le contenu au fond. Ensuite, ajoutez l'anticorps primaire. La quantité d'anticorps utilisée doit être titrée pour chaque lot et pour chaque fabricant.

Dans ce cas, nous ajoutons cinq microgrammes d'anticorps primaire, puis du tampon d'immunoprécipitation ou tampon IP jusqu'à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, l'ADN d'immunoprécipitation est placé dans un rotateur et incubé à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Une rotation est nécessaire pour éviter la conglobération des anticorps dans le tube pendant l'incubation.

Environ 15 minutes avant la fin de l'incubation avec l'anticorps primaire, nettoyez et préparez les billes magnétiques Dyna. Tout d'abord, remettez bien en suspension les billes dans le flacon par vortexage. Ensuite, transférez 30 microlitres de billes dans un tube neuf siliconé et placez ce tube sur un support magnétique pour plusieurs réactions.

Transférez 30 microlitres de billes par réaction, plus suffisamment pour une réaction supplémentaire afin de tenir compte d'une erreur de pipetage ou d'une perte accidentelle de certaines billes. Par exemple, pour huit réactions, prélèvez suffisamment de billes pour neuf réactions, soit 270 microlitres.

Les billes magnétiques seront attirées vers la paroi du support magnétique. Laisser deux minutes pour que les billes migrent et se déposent en une bande bien définie sur la paroi du tube. Ensuite, retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette en veillant soigneusement à ne pas déranger les billes situées sur la paroi arrière avec la pointe de la pipette.

Remplacez le surnageant par un volume excédentaire de tampon IP, vortexez et replacez-le sur le support magnétique pendant deux minutes. Répétez ce lavage une fois supplémentaire et remettez en suspension les billes de lavage dans leur volume initial de tampon IP. Récupérez le tube d'échantillon du rotateur lorsque l'incubation est terminée.

Pour terminer l'immunoprécipitation, ajouter 30 microlitres de billes propres à la réaction et replacer le tube dans un rotateur pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pendant cette incubation, l'anticorps secondaire, qui est un anti-IgG de souris, se liera à l'anticorps primaire de souris. Les anticorps anti-souris sont conjugués à des billes magnétiques Dyna, permettant une récupération facile des produits liés et la purification qui suit.

Une fois l'incubation avec les deux anticorps terminée, placez le tube d'IP sur le support magnétique pendant deux minutes. À ce stade, l'ADN méthylé sera lié par l'anticorps primaire, qui lui-même sera lié à l'anticorps secondaire conjugué aux billes Dyna. Retirez et jetez le surnageant, puis remplacez-le par 500 microlitres de tampon d'IP.

Mélangez le contenu du tube et replacez-le sur le porte-échantillons pendant deux minutes. Répétez ce lavage une fois supplémentaire avec le tampon IP. Après avoir éliminé le surnageant du dernier lavage Resus, resuspendez les billes pour la dernière fois.

Dans 400 microlitres de tampon de digestion, traitez la réaction avec 100 microgrammes de protéinase K et incubez toute la nuit à 50 degrés Celsius. Le traitement par la protéinase K est nécessaire pour digérer les protéines d'anticorps et toute protéine résiduelle associée à l'ADN, permettant ainsi la libération de l'ADN méthylé en solution. La purification de l'ADN est réalisée le deuxième jour de la procédure de rencontre ; retirez le tube de digestion de l'incubateur.

Dans une hotte, ajoutez 500 microlitres de phénol-chloroforme un-à-un à pH sept dans le tube et mélangez soigneusement par vortex. Faites centrifuger le tube pendant 10 minutes à 13 000 ×g. Retirez délicatement la phase aqueuse supérieure du tube sans perturber l'interface ni prélever une partie de la phase organique. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube.

Une seconde extraction peut être effectuée si l'interface apparaît trouble. Ensuite, ajoutez un dixième du volume d'acétate de sodium trois molaire, dans ce cas, 40 microlitres. Un microlitre de glycogène peut être utilisé comme agent porteur pour faciliter le nettoyage du culot.

Vortexez le tube pour mélanger le contenu. Ajoutez ensuite deux volumes d'éthanol à 100 %, vortexez et placez au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes après congélation. L'ADN précipité est centrifugé à 13 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Un culot d'ADN se formera au fond du tube. Retirer le tube de la centrifugeuse et éliminer l'éthanol. Veiller à ne pas perturber le culot au fond du tube.

Une courte centrifugation peut être nécessaire pour éliminer tout éthanol résiduel. Pour laver le culot, ajoutez 500 microlitres d'éthanol froid à 70 %, vortexez, puis centrifugez à nouveau pendant 20 minutes à 13 000 g et à quatre degrés Celsius. Lorsque la deuxième centrifugation est terminée, retirez l'éthanol à 70 % par une courte centrifugation et éliminez l'éthanol résiduel à l’aide d’une pipette.

Laissez le tube sur un support, avec le bouchon ouvert, pour sécher le culot et permettre l'évaporation de l'éthanol résiduel. Enfin, reprendre le culot contenant uniquement l'ADN enrichi en méthylation avec 10 microlitres d'eau stérile, en laissant suffisamment de temps pour que le culot d'ADN se dissolve avant utilisation. Il est recommandé de valider l'efficacité de l'enrichissement par PCR.

Cela peut être réalisé en effectuant des réactions de PCR conçues pour amplifier de manière différentielle des produits illustrant des fragments d'ADN méthylés et non méthylés à l'aide de primers spécifiques de l'ADN humain normal. La région contrôle d'empreinte H19 peut être utilisée conjointement avec des primers conçus pour amplifier une région du génome qui n'est pas méthylée. Des exemples de séquences de primers et de conditions de cyclage en PCR sont indiqués dans le protocole associé.

À ce stade, il est nécessaire de récupérer l'ADN témoin ou de référence mis de côté au début du protocole de meetup. Un premier jeu de réactions de PCR sera mis en place en utilisant l'ADN témoin, et un second jeu utilisera l'ADN IP enrichi en méthylations. Si le meetup a réussi, la PCR IP produira un produit avec les amorces de méthylation et aucun produit avec les amorces de contrôle.

En revanche, la PCR d'entrée devrait produire des produits en utilisant les deux amorces, car elle contient à la fois des fragments d'ADN méthylés et non méthylés. L'ADN enrichi en fragments méthylés peut être utilisé pour diverses applications en aval, telles que le séquençage par PCR et l'analyse par puces à ADN.

Lorsqu'elle est associée à d'autres techniques de biologie moléculaire, elle peut être utilisée pour étudier l'état de méthylation de l'ADN de manière spécifique à un locus ou à l'échelle du génome entier, afin d'effectuer un profilage de la méthylation ou d'étudier l'épigénomique.