Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Je m'appelle Maria et je travaille chez Y Healthcare au NOS en Suède. Les protéines de surface cellulaire sont souvent impliquées dans la communication entre les cellules et leur environnement, ce qui les rend particulièrement intéressantes pour la recherche, visant à mieux comprendre les maladies ainsi que d'autres variations biologiques induites par des changements dans l'environnement cellulaire. Dans cette vidéo, je vais vous montrer un protocole simple de marquage des protéines de surface cellulaire en mode « side-eye dodge », qui vous permettra de visualiser et d'enrichir ces protéines peu abondantes sans amplification physique, et d'étudier les différences entre ces protéines de surface cellulaire à l'aide de cette technologie.

Si cette technologie vous intéresse, vous pouvez consulter le manuel 2D pour obtenir davantage d'informations. De plus, nous disposons d'une note d'application sur ce sujet particulier, que vous pouvez télécharger depuis job. Dans le protocole d'étiquetage de la surface cellulaire illustré ci-dessus, vous étiquetez les cellules alors qu'elles sont encore intactes. Pendant le processus d'étiquetage, le colorant n'a accès qu'aux protéines de la surface cellulaire.

Après l'étape de marquage, les cellules sont analysées afin de vérifier un marquage spécifique de la surface cellulaire. L'échantillon marqué a été fractionné en protéines membranaires et cytosoliques. Un échantillon non fractionné a été préparé en parallèle.

Pour comparaison, cette analyse par fractionnement n'est pas nécessaire, mais a été réalisée ici uniquement pour montrer que le protocole de surface cellulaire est spécifique aux protéines de surface cellulaire. Nous avons également effectué le protocole standard d'étiquetage sans repas ETH, illustré ci-dessous, dans lequel les cellules sont lysées avant l'étiquetage, permettant ainsi à toutes les protéines cellulaires d'être accessibles à l'étiquetage. Après l'étape d'étiquetage, les échantillons sont soumis à une électrophorèse bidimensionnelle.

Les cellules adhérentes sont détachées à l'aide d'une procédure non enzymatique afin d'éviter la digestion des protéines de surface cellulaire ciblées. Dans ce protocole, nous utilisons le racloir en caoutchouc, mais l'utilisation d'un milieu de dissociation cellulaire enzymatique constitue également une option. Comptez et répartissez les suspensions cellulaires en aliquotes de cinq à dix millions de cellules par tube. Les cellules sont ensuite centrifugées et lavées dans du H-P-S-S-P-H 7,4 pour éliminer les traces de culture cellulaire.

La contamination du milieu par des protéines sériques et des composants fluorescents peut interférer avec le marquage et la détection. Les cellules en suspension sont directement centrifugées et lavées avant l'étape de marquage, après le lavage. Le culot cellulaire est resuspendu dans 200 microlitres de tampon de marquage glacé contenant HPSS à pH 8,5 et une molaire d'urée.

Pour des conditions d'étiquetage optimales des protéines de surface cellulaire, vérifiez toujours le pH. Avant l'étiquetage, nous avons utilisé 600 picomoles de side-eye pour 10 millions de cellules CHO. Le rapport optimal entre side-eye et nombre de cellules variera selon le type cellulaire.

Étant donné que nous ne connaissons pas les concentrations exactes des protéines à la surface des cellules, la détermination des conditions optimales pour le marquage latéral des protéines est décrite dans le manuel des principes et méthodes d'électrophorèse bidimensionnelle. Les cellules sont incubées avec le réactif side eye D floor, en présence de dés minimaux, pendant 20 minutes sur de la glace et à l'abri de la lumière.

Après la réaction de marquage, le colorant non réactif est éteint en ajoutant 20 microlitres de lysine à 10 millimolaire. Les cellules marquées sont ensuite lavées deux fois dans du tampon HPSS froid à pH 7,4 pour éliminer l'excès de colorant. Ainsi, aucun colorant libre ne reste pour un marquage intracellulaire indésirable ou pour les protéines lors de l'étape suivante, qui est la lyse cellulaire.

Les protéines à la surface des cellules sont maintenant marquées et les cellules sont lavées et prêtes à être lysées. Le culot provenant de l'étape de lavage perdue est redissous dans 150 microlitres de tampon de lyse froid contenant sept molar urée, deux molar thiourée, 4 % de CHAPS, 30 millimolaire Tris, cinq millimolaire d'acétate de magnésium, pH 8,5, puis laissé sur glace pendant au moins une heure avec des vortexages occasionnels. Les échantillons sont désormais prêts pour la séparation en deux dimensions.

La première étape de l'électrophorèse consiste à préparer les bandes IPD pour la réhydratation. Préparez la solution de réhydratation en ajoutant le tampon IPG correspondant à l'intervalle de pH des bandes utilisées, puis versez la solution dans les cuvettes de la plaque de réhydratation. Retirez le film protecteur des bandes IPG et placez soigneusement les bandes, avec le gel sec orienté vers le bas, dans la plaque de réhydratation contenant la solution de réhydratation.

Fermez le couvercle de la boîte IPG et réhydratez les bandes toute la nuit. Dans la première dimension, la focalisation isoélectrique, les protéines sont séparées selon leur pi. Ceci est réalisé à l’aide de l’IPG four three.

Les bandes réhydratées sont placées dans le collecteur et l'électrode est fixée sur le dessus. Cinquante microgrammes de chaque échantillon ont été appliqués à l'aide de capuchons d'application. Nous avons soit appliqué directement des échantillons non fractionnés sans fractionnement préalable, soit fractionné les échantillons en fractions membranaires et cytosoliques avant leur application.

Le couvercle est fermé pour protéger les échantillons fluorescents de la lumière. L'appareil a été programmé selon les recommandations et a fonctionné toute la nuit. De grands gels de 12 % de lamby ont été coulés à l’aide d’un système de 12 gels pour adultes.

Une solution de Coster a été ajoutée afin d'éviter la formation de gels d'acrylamide polymérisés dans les tubulures. Les gels ont été laissés polymériser toute la nuit à température ambiante avant utilisation. Après la focalisation isoélectrique, les bandes sont retirées et équilibreées en deux étapes dans un tampon contenant du SDS, en utilisant d'abord du DTT pour réduire les ponts disulfure des résidus de cystéine, suivie d'une alkylation avec de l'acétamide pour éviter toute modification par l'acrylamide.

Les bandes IPG sont plongées dans du tampon de migration et placées soigneusement sur la surface des grands gels bidimensionnels. Évitez de piéger de l'air entre les bandes et les gels en ajoutant une solution d'agarose fondue à 2 % contenant du bleu de bromophénol par-dessus. Les gels sont désormais prêts pour la séparation en deuxième dimension par électrophorèse SDS-PAGE. En deuxième dimension SDS-PAGE.

Les protéines seront séparées selon leur masse moléculaire, et cette étape est réalisée à l’aide du système Tonal Six. Remplissez la chambre d’électrophorèse avec le tampon de migration anodique, insérez les gels et remplissez le compartiment supérieur avec le tampon de migration cathodique. Branchez l’alimentation électrique conformément aux recommandations et faites migrer en deuxième dimension à l’abri de la lumière pendant environ quatre à cinq heures, ou jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le bas du gel.

Après l'électrophorèse en seconde dimension, les cassettes de gel sont placées à l'aide de pinces dans l'analyseur fluorescent Typhoon. Deux gels et trois canaux peuvent être analysés simultanément. Le résultat obtenu avec cette double électrophorèse en deux dimensions montre une résolution élevée des protéines membranaires présentes dans l'échantillon, même s'il existe certaines limitations connues concernant la détection des protéines hydrophobes en double électrophorèse en deux dimensions. Les résultats révèlent de nombreuses nouvelles taches marquées à la surface cellulaire, montrées ici en rouge, qui ne sont pas détectées avec le protocole de marquage standard illustré ici en vert.

Ces résultats montrent que le protocole de marquage de la surface cellulaire est hautement spécifique pour le marquage des protéines de surface cellulaire. Étant donné que seules les protéines de surface cellulaire sont marquées, elles sont plus facilement visualisées et l'atténuation par les protéines cytosoliques abondantes est évitée. L'image fluorescente des gels contenant la fraction membranaire non fractionnée ou la fraction cytosolique est présentée en haut.

Voici une image du même gel après coloration par l'argent. Les résultats ne montrent aucune étiquetage fluorescent des protéines cytosoliques, mais la coloration argentique révèle la présence de protéines dans les gels. Les résultats montrent également des profils de taches similaires entre les fractions non fractionnées et les fractions membranaires, démontrant qu'une fractionation préalable à l'électrophorèse bidimensionnelle n'est pas nécessaire, ce qui rend ce protocole à la fois simple et pratique.

Les échantillons SI deux, SI trois et SCI cinq présentent des profils d'étiquetage similaires et sont tous compatibles avec le protocole de surface cellulaire. Une expérience alimentaire a été réalisée en utilisant les trois types d'yeux latéraux DI floor minimal dy afin d'étudier l'expression différentielle des protéines de surface cellulaire dans les cellules CHO soumises à une privation de sérum pendant des durées variables. Les échantillons de surface cellulaire CY deux provenant de tous les échantillons de l'expérience ont été regroupés et utilisés comme étalon interne.

Les variations différentielles de plusieurs protéines de surface cellulaire ont pu être suivies pendant la période de privation. Plus de 18 protéines membranaires nouvelles ont été détectées à l'aide du protocole de surface cellulaire, protéines qui n'avaient pas été observées avec le protocole standard pour déterminer l'identité des protéines dans le gel préparatif. Il a été nécessaire d'ajouter un échantillon de surface cellulaire pour faciliter la correspondance avec les taches sur le jeu de données analytiques.

Il en résulte une haute résolution permettant de détecter un grand nombre de protéines de surface cellulaire. Ce protocole est très spécifique aux protéines de surface cellulaire, et aucune étiquetage de protéines intracellulaires n'a été observé.

Avec cette méthode, vous êtes en mesure de détecter davantage de protéines de surface cellulaire par rapport à un protocole standard, et comme vous l'avez déjà constaté, c'est un protocole très simple à réaliser. Vous marquez simplement vos protéines de surface cellulaire pendant qu'elles sont encore intactes, puis vous les analysez directement par électrophorèse bidimensionnelle sans fractionnement membranaire. Ce protocole est donc très bien adapté à l'étude des protéines de surface cellulaire et des différences associées à la technologie D.