Une technique de recueil de série du liquide céphalorachidien de la grande citerne de souris

La procédure commence par l'anesthésie de la souris et la préparation du site chirurgical. La souris est ensuite placée en position ventrale sur l'instrument stéréotaxique. Une incision sagittale de la peau est réalisée en dessous de l'occiput, et les tissus sous-cutanés ainsi que les muscles du cou sont écartés par dissociation contondante le long de la ligne médiane.

Ensuite, la partie postérieure du corps est positionnée de manière à former un angle de 135 degrés entre le corps et la tête fixée ; la dure-mère au niveau du grand sternum du CI est pénétrée à l’aide d’une micropipette en verre et le LCR est prélevé. Après le prélèvement du LCR, les muscles sont réalignés et la peau est suturée ; environ un millilitre de solution saline à 0,9 % NACL est injecté par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation, et la souris est maintenue au chaud jusqu’à son réveil. Bonjour, je m’appelle Liu, je travaille au laboratoire de la Dre Karen Duff au Top Institute de l’Université Columbia.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment prélever le liquide céphalorachidien du cisternum magna de la souris. Grâce à cette technique, nous pouvons prélever des échantillons sériés de LCR jusqu'à trois fois chez la même souris, avec un intervalle de deux à trois mois. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette méthode pour déterminer les concentrations du bêta-amyloïde ou de la protéine tau dans le LCR à différents âges chez nos modèles de souris transgéniques de la maladie d'Alzheimer, et nous corrélons ces valeurs avec celles du cerveau.

À la fin, nous nous intéressons au potentiel des taux de bêta ou de tau dans le LCR comme marqueurs biologiques possibles de la progression de la maladie, ainsi que des essais thérapeutiques chez les souris. Commençons donc. Pour cette procédure, il est nécessaire de fabriquer des capillaires à l’aide d’un micropipeteur polar.

Les capillaires utilisés ici sont en verre silicaté BOA B 175 10 de Sutter Instruments ; tirez les capillaires sur un micro-pipeteur flamme Sutter P 87 avec l'indice de chaleur réglé à 300 et l'indice de pression réglé à trois 30. Le capillaire en verre mesure cinq centimètres de long et possède une pointe effilée. La pointe du capillaire est coupée avec des ciseaux afin que son diamètre intérieur soit d'environ 0,5 millimètre.

L'intervention chirurgicale commence par l'anesthésie de la souris à l'aide de kétamine à 100 milligrammes par kilogramme et de xylazine à 10 milligrammes par kilogramme, administrées par voie intrapéritonéale. Pendant l'anesthésie, maintenir la souris au chaud dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois confirmé que l'animal est complètement anesthésié grâce au réflexe de retrait au pincement de l'orteil, raser la région du cou, puis placer la souris sur l'instrument stéréotaxique, comme celui fabriqué par David Kink. En contact direct avec le tapis chauffant, insérer une sonde de température rectale afin de régler la chaleur du tapis en fonction de la température corporelle de la souris.

Fixez la tête avec les adaptateurs crâniens, désinfectez la peau du cou à l’aide de bétadine à 10 % et d’éthanol à 70 %, en effectuant trois passages, puis pratiquez une incision sagittale en dessous de la partie postérieure de la tête ou de l’occiput. Les étapes suivantes doivent être réalisées sous un microscope de dissection en utilisant une pince effilée. Séparez les tissus sous-cutanés et les muscles M par ventor services et M rectus capita dorsalis major afin d’exposer correctement la dure-mère du foramen magnum. Utilisez correctement une paire de rétracteurs microchirurgicaux pour maintenir les muscles écartés.

Enfin, placez la souris sur le côté avec la tête formant un angle de 135 degrés par rapport au corps. La souris est désormais prête pour le prélèvement de liquide céphalorachidien (LCR). Cette technique de prélèvement du LCR au niveau du foramen magnum a été publiée précédemment.

Figure C un A sous le microscope stéréoscopique. La dure-mère apparaît comme un triangle inversé brillant et transparent à travers lequel la moelle oblongue et un vaisseau sanguin majeur sont visibles. Artéria dural spinella, figure C un B. On peut observer la pulsation circulatoire de la moelle et de l'espace adjoint de liquide céphalorachidien.

Asséchez la dure-mère avec un coton stérile, puis insérez la capillaire dans le sternum CI magna en traversant la dure-mère latéralement par rapport à l'artéria dorsalis spinels. Une variation notable de la résistance indiquera que la capillaire est correctement insérée, et le LCR commencera alors à s'écouler dans la capillaire. Une fois le LCR collecté, retirez soigneusement la capillaire et reliez-la à une seringue de trois millilitres à l’aide d’un tube en polyéthylène dont le diamètre interne est d’un millimètre.

Injecter le LCR dans un tube de 0,5 millilitre. Étiqueter le tube et le congeler immédiatement sur de la glace sèche. Une fois congelé, transférer le LCR dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

La technique d'échantillonnage que l'on vient de démontrer est extrêmement douce et permet de prélever ultérieurement des échantillons de LCR sur la même souris pendant un intervalle de deux à trois mois. Ainsi, après le prélèvement, les muscles et la peau du cou doivent être réalignés et fermés par des points de suture. Une fois l'incision suturée, injecter environ un millilitre de solution saline à 0,9 % NACL par voie sous-cutanée afin de réhydrater la souris.

Gardez la souris au chaud à environ 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elle se rétablisse. Surveillez son poids au jour un et au jour sept après la chirurgie. Je viens de vous montrer comment prélever le liquide céphalorachidien du système mag de la souris.

Lors de cette procédure, trois points importants doivent être retenus. Premièrement, positionner correctement la tête et le corps de la souris sur le cadre stéréotaxique afin d'exposer au maximum l'ator du Cy Magna. Deuxièmement, éviter soigneusement les vaisseaux sanguins lors de la pénétration du duromètre avec la capillarité.

Sinon, votre échantillon sera contaminé par le sang. Enfin, n’oubliez pas de maintenir vos souris au chaud pendant toute la procédure afin d’éviter l’hypothermie. L’hypothermie est non seulement nocive pour vos souris, mais elle peut également affecter de manière significative vos résultats en induisant une production bêta ou une relation d’hypophosphorylation des lymphocytes T.

D'accord, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.