עיבוד יעיל של תאי עזר זקיקי T שקדים וניתוח פונקציונלי באמצעות ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים

Qin Xu; Lihong Shi; Brian L. P. Dizon; Rylee J. Beam; Pamela Mudd; Pamela L. Schwartzberg; Kalpana Manthiram

doi:10.3791/67188

מאמר שיטה

עיבוד יעיל של תאי עזר זקיקי T שקדים וניתוח פונקציונלי באמצעות ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים

DOI:

10.3791/67188

⸱

11 ביולי 2025

Qin Xu¹ , Lihong Shi¹ , Brian L. P. Dizon²^,³ , Rylee J. Beam² , Pamela Mudd⁴^,⁵ , Pamela L. Schwartzberg¹ , Kalpana Manthiram¹

¹Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, ²Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, ³Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, ⁴Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, ⁵Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף ועיבוד דגימות שקדים, פנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרלית בממדים גבוהים וביצוע אנליזה ללא פיקוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי עזר זקיקי T (Tfh) הם תת-קבוצה של תאי עזר CD4⁺ T המסייעים בהחלפת איזוטיפ של תאי B, היווצרות מרכז נבט (GC), היפרמוטציה סומטית והבשלת זיקה, ובכך עוזרים לתאם תגובות חיסוניות הומורליות אדפטיביות ברקמות לימפה משניות במהלך זיהום, אוטואימוניות וחיסון. הבנת ההתפתחות והתפקוד של תאי Tfh חיונית לתכנון חיסונים יעילים ולפיתוח אסטרטגיות טיפול ממוקדות למחלות הכוללות אוכלוסייה זו. תאי שקדים אנושיים הם איברי לימפה ריריים נגישים. הם מציעים הזדמנות ייחודית ליצור פרופיל של אוכלוסיות חיסוניות שונות כמו תאי Tfh ו-GC, לחקור אינטראקציות בין תאים, להעריך תפקודים תאיים דינמיים ולחשוף את מנגנוני הבקרה שלהם ברמת האיברים. בנוסף, תרביות מבחנה של תאי שקדים פשוטות לעיבוד ומאפשרות הערכה של הביולוגיה של תאי Tfh בתנאים שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף, בידוד, שימור ותרבית של תאי שקדים אנושיים. אנו מתארים גם שני לוחות ציטומטריית זרימה ספקטרלית אופטימליים המיועדים לאפיון מעמיק של תאי Tfh. לבסוף, תוך שימוש בטיפול במעכב חלבון פוספטאז 2A (PP2A) כדוגמה, אנו מדגימים את היעילות והעוצמה של ניתוחים לא מפוקחים של נתוני ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים, וחושפים ביעילות הבדלים הנגרמים על ידי טיפול בקנה מידה רב-ממדי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי עזר זקיקי T (Tfh) הם תת-קבוצה מובחנת של תאי T מסייעים CD4⁺ החיוניים להיווצרות ותפקוד של מרכזי נבט (GCs) וייצור נוגדנים של תאי B. תאי Tfh מקורם בתאי CD4⁺ T נאיביים באמצעות אינטראקציות עם תאים מציגי אנטיגן ושילוב של גורמים פנימיים וחיצוניים, כולל איתות קולטני תאי T, אינטראקציות קוסטימולטוריות עם תאי B, ציטוקינים וכימוקינים¹. תאי Tfh מבטאים CXCR5 ו-PD-1, המנחים את מיקומם בתוך ה-GC או בקרבתו. BCL-6 הוא גורם השעתוק הראשי הקריטי להתפתחות, תחזוקה ותפקוד Tfh ^1,2. תאי Tfh הם חיוניים להגברת תגובות חיסוניות הומורליות, במיוחד בתגובות חיסון ובהגנה מפני פתוגנים חיידקיים וויראליים. תגובות חריגות של תאי Tfh מעורבות בהפרעות שונות, כולל מחלות אוטואימוניות, כשל חיסוני ופוטנציאל לצורות מסוימות של סרטן 3,4,5,6. הבנת תפקודם והרגולציה שלהם, אם כן, חשובה לפיתוח אסטרטגיות חיסון וטיפוליות יעילות⁷.

בניגוד לתאי CD4⁺ T מסייעים אחרים כמו Th1, Treg ו-Th17, שעבורם מערכות התמיינות במבחנה ^{מבוססות היטב 8}, תאי Tfh מורכבים יותר למחקר מכיוון שהתפתחותם כרוכה באינטראקציות דינמיות בין תאים ומבנים אנטומיים מיוחדים⁷. לפיכך, מחקרים על תאי Tfh הסתמכו במידה רבה על פנוטיפ ex vivo של תאי Tfh במחזור היקפי אנושי (cTfh) ומודלים של עכברים in vivo . לכן חקירת הוויסות של מולקולות ספציפיות על תאי Tfh היא מאתגרת, במיוחד עבור תאי Tfh אנושיים⁹. לפיכך, מחקר מעמיק ex vivo של תאי Tfh שמקורם ברקמות לימפה חיוני לשיפור ההבנה שלנו לגבי תאי Tfh אנושיים.

שקדים, כאיברי לימפה משניים, מכילים אוכלוסיות תאים ייחודיות שאינן קיימות בדם היקפי, כגון תאי קדם-Tfh (CXCR5^intPD-1^intCD4⁺) ו-GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺), שניהם חיוניים ביצירת GCs. יתר על כן, השקדים הפלאטיניים הם חלק מהרקמות הנפוצות ביותר שהוסרו בניתוחי ילדים והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם למקור רקמות אנושיות שלא יסולא בפז לחקר מנגנונים חיסוניים מורכבים הכוללים תאי Tfh. מכיוון שהם ממוקמים בדרכי הנשימה העליונות, אתר עיקרי לזיהומים נגיפיים בדרכי הנשימה, השקדים מציעים רקמה מועילה לחקירת תגובות חיסוניות לזיהומים נגיפיים כאלה. לדוגמה, המעבדה שלנו אפיינה בעבר תאי Tfh בשקדים ואדנואידים של ילדים שהחלימו מ-COVID-19 והשוותה את הרקמות הללו לאלו מבקרות לא נגועות¹⁰. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לעיבוד ואחסון תאי שקדים. באמצעות שקדים שטופלו במעכב PP2A כדוגמה, אנו מפרטים כיצד לאפיין תאים אלה באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרלית בממדים גבוהים ומנתחים את הנתונים באמצעות ניתוח לא מפוקח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצהרת הלסינקי) בוצע בכל המחקר בבני אדם במחקר זה. דגימות שקדים אנושיים התקבלו מחולים עם היפרטרופיה של אדנוטונסילר הגורמת להפרעות נשימה בשינה או דום נשימה חסימתי בשינה, שמקורם במחלקה לרפואת אף אוזן גרון ילדים, בית החולים הלאומי לילדים, וושינגטון די.סי., ארה"ב. מחקר זה קיבל אישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) בבית החולים הלאומי לילדים (פרוטוקול IRB מספר 00009806). הסכמה מדעת נחתמה על ידי ההורים או האפוטרופוסים של כל המשתתפים הרשומים, והסכמה התקבלה ממשתתפים קטינים בני 7 ומעלה.

1. איסוף שקדים אנושיים ובידוד ואחסון של תאים בודדים

בידוד של תאים בודדים בשקדים
1. איסוף דגימות כירורגיות
  1. השג שקדים ממטופלים שעברו כריתת שקדים ואסוף את חלקי הרקמה הטרייה בחדר הניתוח בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל מלא ב-25-35 מ"ל של מדיום שקדים סטרילי קר כקרח: RPMI בתוספת 5% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 10 מ"מ גלוטמין ותערובת אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100 יחידות/מ"ל סטרפטומיצין, 100 יחידות/מ"ל פניצילין, ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B).
    הערה: ניתן לאחסן שקדים במדיום הנ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולעבד אותם למחרת. אובדן מינימלי של כדאיות התאים נצפה עם אחסון לילה לעומת עיבוד באותו יום (איור 1A). ניתן לשלוח שקדים גם בן לילה על קרח.
2. עיבוד שקדים
  הערה: כל המדיה, המאגרים וכלי הניתוח חייבים להיות סטריליים, ובידוד תאי השקד צריך להתבצע על קרח במכסה מנוע ביולוגי.
  1. מניחים את השקדים על צלחת תרבית תאי פלסטיק בגודל 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל של מדיום שקדים צונן. עבדו על קרח. בעזרת פינצטה סטרילית ומספריים או אזמל, הסירו בזהירות את כל קרישי הדם, השומן ורקמת החיבור הנראים לעין (איור 1B,C).
  2. העבירו את השקדים לצלחת תרבית תאים חדשה בגודל 60 מ"מ עם 5 מ"ל של מדיום שקדים קר כקרח. פורסים את חתיכות השקד לשברים של 3-5 מ"מ.
  3. מכינים צלחת תרבית תאים חדשה בגודל 60 מ"מ עם 10 מ"ל מדיום שקדים קרים ומניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר בתבשיל.
  4. העבירו את שברי השקדים למסננת ומרסקים את שברי השקדים באמצעות קצה הבוכנה של מזרק סטרילי של 3 מ"ל דרך המסננת.
  5. אוספים את המדיום המכיל תאים מחוץ למסננת בצלחת ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  6. מוסיפים לתבשיל עוד 10 מ"ל מדיום שקדים עם המסננת, מרסקים את שברי השקדים בעזרת הבוכנה ואוספים את המדיום בצינור החרוטי. עבור שקדים גדולים, חזור על שלב זה 2-3 פעמים יותר עד שנשארים רק שברי רקמת חיבור במסננת. הכניסו את הרקמה הנותרת והצלחות המשומשות לשקית ביולוגית ולפסולת הרפואית.
  7. מלאו את הצינור החרוטי של 50 מ"ל למעלה במדיום שקדים.
  8. צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הארכת הצנטריפוגה ל-20 דקות עשויה להגדיל את התשואה.
  9. הסר את הסופרנטנט על ידי יניקה בזהירות או פיפטינג החוצה והשהה מחדש את הכדור ב-5 מ"ל של מאגר אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) בטמפרטורת החדר (RT) כדי ליז כדוריות דם אדומות. דגירה למשך 5 דקות ב-RT, ולאחר מכן הוסף 35 מ"ל של PBS צונן כדי למנוע ליזה נוספת. צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. שוטפים פעם אחת עם 50 מ"ל PBS צונן וצנטריפוגה. השעו מחדש עם 10 מ"ל PBS ותאי מתח דרך מסננת פלסטיק של 70 מיקרומטר. ספירת תאים.
שימור בהקפאה של תאי שקדים
1. הכן מדיום הקפאה (90% FBS מומת חום ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO)).
  הערה: ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
2. צנטריפוגה את מתלה התאים (שלב 1.1.2.10) ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא עם מדיום הקפאה.
  הערה: אנו ממליצים להקפיא את התאים בצפיפות של 10 × 10⁶ עד 50 × 10⁶ תאים/מ"ל של מדיום הקפאה¹¹.
3. Aliquot 0.5-1 מ"ל של תרחיף התאים לקריובילים סטריליים. הקפיאו את הבקבוקונים במיכלי הקפאה מבוקרי קצב במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. העבירו את הבקבוקונים למיכל אחסון המכיל חנקן נוזלי תוך שבוע לשימור לטווח ארוך.
הפשרת תאים קפואים
הערה: גישת הפשרה בדילול רציף המוזכרת מפרוטוקול הכנת דגימה לריצוף RNA של תא בודד מתוארת להלן¹². שיטות הפשרה אחרות עשויות גם הן לעבוד, אולם מצאנו כדאיות תאים גדולה יותר בגישה הזו בהשוואה להכנסת תאים מיד למאגר הפשרה חם (איור 1D). ניתן להכין את מאגר הכביסה מבעוד מועד. מאגר ההפשרה מורכב ממאגר כביסה בתוספת 0.1 מ"ג/מ"ל DNase I (DNase I יש להוסיף ממש לפני תחילת ההפשרה). הגדלת זמן הצנטריפוגה לדקה / מ"ל (עבור צינורות של 15 מ"ל) היא אופציונלית כדי להגדיל את תפוקת התא.
1. יש לחמם אמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את ההפשרה ואת מאגר הכביסה באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס.
  הערה: כל שטיפת התאים מבוצעת ב-RT.
2. הפשירו את הקריוביאלים באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות מיד לאחר הוצאתם מהאחסון. הימנע מטבילה מלאה של הבקבוקון באמבט המים. הוציאו את הבקבוקון מאמבט המים בזמן שגביש קרח קטן נשאר גלוי.
3. העבירו בעדינות תאים מופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה רחב קדח במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית. שטפו את הקריוביאל עם 0.5 מ"ל של מאגר הפשרה שחומם מראש, והוסיפו את השטיפה טיפה אחר טיפה (טיפה אחת כל 5 שניות) לצינור החרוטי של 15 מ"ל, תוך נער בעדינות את הצינור לערבוב.
4. לדלל תאים ברצף בצינור החרוטי של 15 מ"ל על ידי הוספה הדרגתית של 2 מ"ל ולאחר מכן 4 מ"ל של מדיום עם זמן המתנה של ~1 דקה בין תוספות. מוסיפים בינוני בקצב של 1 מ"ל כל 3-5 שניות לשפופרת, מסתחררים בעדינות לערבוב.
5. צנטריפוגה ב 400 × גרם למשך 5 דקות ב- RT.
6. הסר את הסופרנטנט; להשעות מחדש את גלולת התא ב-300 מיקרוליטר של מאגר הפשרה; ודגירה ב-RT למשך 5 דקות.
7. הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה (ללא DNase I). שוב צנטריפוגה ב -400 × גרם למשך 5 דקות ב- RT.
8. שטפו פעם נוספת: הסירו את חומר העל והשעו מחדש את כדור התא ב-10 מ"ל של מאגר כביסה. צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
9. מסננים את התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר. צנטריפוגה שוב למשך 5 דקות ב-400 × גרם ב-RT וספרו את התאים. השעיה במדיום תרבותי.

2. מדידת ביטוי של ציטוקינים תוך-תאיים וגורמי שעתוק לאחר טיפול ex vivo

הערה: כאן, אנו מפרטים את השיטה שלנו לאפיון פנוטיפי של תאי Tfh שקדים באמצעות שני לוחות ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים. בהתחשב בכך שפעילות PP2A חיונית לביטוי אופטימלי של חלבון BCL-6 ולהתמיינות Tfh⁴, אנו מדגימים את הערכתנו לגבי תחזוקת תאי Tfh ותפקודם באמצעות בחינת תאי שקדים שטופלו במעכב PP2A קנתרדין (CAN).

צביעה ציטומטרית זרימה
1. צביעת ציטוקינים תוך-תאיים
  הערה: הדגירה מבוצעת בחושך. ריאגנטים, נוגדנים והכמויות שלהם לכל באר המשמשת בשני הפאנלים מפורטים בטבלת החומרים. כדי להעריך דה-גרנולציה של תאי T, הנוגדן נגד CD107a מתווסף במהלך שלב הטיפול כדי למזער תוצאות שליליות כוזבות הנגרמות על ידי הפנמתו¹³.
  1. לוח 2 × 10⁶ תאי שקדים עם 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית (1 × 10⁷ תאים/מ"ל) בבאר צלחת תחתונה U של 96 בארות עם הכמויות הבאות של מעכב PP2A CAN למשך 16 שעות: בקרת רכב, 3 מיקרומטר ו-6 מיקרומטר.
    הערה: CAN הורכב מחדש ב-0.1 מיליון עם 1% DMSO.
  2. הוסף מוננסין (0.7 מיקרוליטר/מ"ל), ברפלדין (1:1,000), פורבול מיריסטט אצטט (50 ננוגרם/מ"ל, PMA), יונומיצין (1,000 ננוגרם/מ"ל) ו-2 מיקרוליטר אנטי-CD107a לכל באר למשך 2.5 שעות בחממה של 5% CO₂ ב-37 ^מעלותצלזיוס.
  3. צנטריפוגה מכתים נוגדנים ב-~16,000 × גרם למשך 3-5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת אגרגטים של נוגדנים. הכן את תערובת הנוגדנים על פני השטח לשלב 2.1.1.8, הכולל את כל הנוגדנים על פני השטח למעט קולטני הכימוקין, Brilliant Stain Buffer Plus ומאגר FACS (נפח כל אחד מהם מצוין בטבלת החומרים, סה"כ 112 מיקרוליטר תערובת לכל תגובה).
  4. לאחר השלמת 2.5 שעות בתרבית, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בין כביסות, השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת במהירות. בצע צביעה באותה צלחת.
  5. דגרו את התאים ב-100 מיקרוליטר לבאר של 1:800 צבע כחול חי/מת מדולל ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT. שטפו פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  6. השעו מחדש את התאים עם חוסם מונוציטים כתמים אמיתיים (חוסם מונוציטים של 5 μL + מאגר FACS של 45 μL לבאר) למשך 5 דקות ב-RT.
  7. הוסף ברצף נוגדנים לקולטן כימוקין ישירות לתגובת הצביעה (תחילה, anti-CXCR3 ו-anti-CCR7 למשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן תערובת של anti-CXCR5 ו-anti-CCR6 יחד עם 10 μL של Brilliant Stain Buffer Plus למשך 5 דקות ב-RT). מערבבים היטב לאחר כל הוספה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. ראה טבלת החומרים לנפח נוגדנים.
  8. הוסף את תערובת הנוגדנים על פני השטח שהוכנה בשלב 2.1.1.3 ישירות לתגובת הצביעה ודגירה למשך 30 דקות ב-RT. נפח הצביעה הכולל לתגובה הוא 180 מיקרוליטר: חוסם מונוציטים של 50 מיקרוליטר במאגר (ראה שלב 2.1.1.6) + 18 מיקרוליטר של נוגדנים לקולטן אנטי-כימוקין (ראה שלב 2.1.1.7) + 112 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים על פני השטח (ראה שלב 2.1.1.3).
  9. שטפו פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS קר.
  10. השעו מחדש את התאים ודגרו עם 80 מיקרוליטר/באר של מאגר קיבוע מבוסס פרפורמלדהיד ב-RT למשך 20 דקות.
  11. הוסף 160 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל באר, שכבר מכיל מאגר קיבוע. צנטריפוגה את הצלחת ב-400 × גרם למשך 2 דקות ב-RT ושטיפה 1x עם 200 מיקרוליטר של מאגר חדירה.
  12. הכן תערובת נוגדנים לציטוקינים תוך-תאיים (ICS), הכוללת נוגדנים נגד ציטוקינים, Brilliant Stain Buffer Plus ומאגר חדירות (נפח כולל 50 מיקרוליטר לבאר, טבלת חומרים). דגרו את התאים עם תערובת נוגדנים ציטוקינים תוך-תאית זו ב-RT למשך 30 דקות.
  13. יש לשטוף פעמיים עם מאגר חדירות של 200 מיקרוליטר לבאר. השעיה מחדש עם 200 μL/באר של חוצץ FACS.
  14. אחסן את התאים המוכתמים ב-4 מעלות צלזיוס בחושך ורכוש נתונים על ציטומטר זרימה ספקטרלי תוך 24 שעות כדי למזער את אובדן עוצמת הצביעה¹⁴.
2. צביעת גורם שעתוק גרעיני
  1. תרבית התאים עם CAN כמו בשלב 2.1.1.1 (מבלי לגרות את התאים).
  2. הוסף נוגדן CD40 אנטי אנושי (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) למדיום התרבית ותרבית עם תאים למשך 15 דקות לפני תחילת הצביעה. אם תאים מגורים, הוסף נוגדן זה 15 דקות לפני תחילת הגירוי כדי למנוע הפנמה של CD40L עם ההפעלה^15,16.
  3. צנטריפוגה של הנוגדנים המכתימים והכנת תערובת הנוגדנים על פני השטח בדומה לשלב 2.1.1.3: נוגדנים על פני השטח בטבלת החומרים, 10 מיקרוליטר/באר של Brilliant Stain Buffer Plus, ו-54.1 מיקרוליטר/באר של מאגר FACS.
    הערה: נפח הצביעה הכולל לבאר הוא 180 מיקרוליטר: 50 מיקרוליטר של חוסם מונוציטים במאגר + 13 מיקרוליטר של נוגדנים לקולטן כימוקין + 117 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים על פני השטח.
  4. שטפו את התאים ובצעו צביעה LIVE/DEAD Blue וצביעה ושטיפות על פני השטח כמו בשלבים 2.1.1.5-2.1.1.8.
    הערה: הנוגדן נגד CXCR3 אינו כלול בפאנל זה.
  5. תקן את התאים עם 80 מיקרוליטר של מאגר קיבוע גורם שעתוק גרעיני מ-FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer. דגירה למשך 30 דקות ב-RT.
  6. שטפו את התאים עם מאגר חדירות כמו בשלב 2.1.1.11.
  7. הכן את תערובת הנוגדנים של גורם השעתוק התוך-תאי (TF), הכוללת נוגדנים לגורם אנטי-שעתוק המפורטים בטבלת החומרים, 10 מיקרוליטר של מאגר כתמים מבריק פלוס, ו-16 מיקרוליטר של מאגר חדירות (נפח כולל 40 מיקרוליטר לבאר). דגרו את התאים בתערובת זו למשך שעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  8. לשטוף ולרכוש על ציטומטר ספקטרלי כמו בשלבים 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. ניתוח ללא פיקוח של נתוני ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים

הערה: תוכנות, חבילות והגרסאות שלהן המשמשות לניתוח מפורטות בטבלת החומרים. לכידות מסך משלבים 3.2 עד 3.4 נמצאות בקובץ משלים 1. קבצי Script לדוגמה משלבים 3.5 עד 3.7 נמצאיםבקובץ השלמה S 2 ובקובץ משלים 3, שלבים 3.8 עד 3.9 נמצאים בקובץ משלים 4 ובקובץ משלים 5. קבצי ICS גולמיים וקבצי TF גולמיים עבור הסקריפטים מסופקים בקובץ משלים 6 ובקובץ משלים 7, בהתאמה.

פתח את סביבת העבודה של תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה שבה מאוחסנים קבצי ".fcs" והשלם את השער כפי שמוצג באיור 1E.
לחץ לחיצה ימנית על צומת היעד (תאי CD4⁺ T במקרה זה). בחר בחר צמתים שווי ערך.
לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני על צומת היעד. בחר ייצוא/שרשור אוכלוסיות.
המתן לפתיחת החלון אוכלוסיות: ייצוא או שרשור , בחר ערכי ערוץ CSV ובחר את היעד עבור קבצים מיוצאים. כלול את כל התאים בתיבה כלול אירועים ובחר את כל הפרמטרים בתשלום בתיבה פרמטרים . הרחיבו את האפשרויות המתקדמות, הקלידו קידומת לשינוי שמות הקבצים ולחצו על 'ייצוא' כדי לייצא את הקבצים לתיקיית היעד (ייצאו קובץ .csv אחד לכל דוגמה).
קרא את קבצי "*.csv" המיוצאים עם R (אחד לכל דוגמה). הקצה מזהה לדוגמה לכל תא ושלב תאים מכל הדגימות למסגרת נתונים אחת.
הוסיפו או מזגו מטא-נתונים (מידע נוסף על דוגמאות) למסגרת הנתונים.
דגימה אקראית של מספר שווה של תאים לדגימה עבור הניתוח הבא. שלב זה הוא אופציונלי.
הערה: בדוגמה זו, 8,000 תאי CD4⁺ T עברו דגימת הפחתה מסך תאי CD4⁺ T של כל תנאי, המייצגים לפחות 1/7 מהמספר הכולל של תאי CD4⁺ T.
צור אובייקט Seurat: פרש ערכי ערוץ עבור סמני נוגדנים כרמות ביטוי גנים בעת יצירת אובייקט Seurat.
1. צור אובייקט Seurat עם מסגרת הנתונים שנוצרה משלב 3.6. דלג על שלב NormalizeData ושמור אותם ישירות כבדיקת "נתונים".
2. בחר את סמני פני השטח מלוח הזרימה לשימוש כתכונות משתנות באשכולות ללא פיקוח.
3. הפעל את ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP כצינור הסטנדרטי שהוצג מ-Seurat למעט שלב¹⁷ של NormalizeData.
4. התאם את פרמטר הרזולוציה בשלב FindClusters כדי לשנות את מספר האשכולות, ולהבטיח שהם משקפים בצורה מדויקת יותר את ההקשר הביולוגי הבסיסי.
השתמש בכלי תצוגה חזותית כגון DimPlot ו- FeaturePlot התואמים לחבילת Seurat. להשוואת קבוצות המכילות מספר מדגמים לכל קבוצה, חישבו את האחוז של כל אשכול על בסיס כל נושא ובצעו השוואות סטטיסטיות. לאחר מכן, השתמש במודלים מתמטיים לניתוחים סטטיסטיים מתוחכמים יותר¹⁰.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשוות את הכדאיות הכוללת של התאים, חתכנו את השקד לשלושה חלקים דומים ועיבדנו אותם באמצעות הפרוטוקול שלנו בשלושה תנאים: (1) עיבוד באותו יום, (2) אחסון לילה ב-4 מעלות צלזיוס, ו-(3) אחסון לילה על קרח. הכדאיות בין שלושת המצבים האלה הייתה די דומה ללא כל הבדל משמעותי (איור 1A). הערכנו גם את ההשפעה של תהליך ההפשרה על כדאיות התאים. שיטת ההפשרה הטיפה בה השתמשנו הביאה לכדאיות תאים גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לשיטת ההפשרה הישירה לאחר הפשרת דגימות שקדים קפואות מאותו תורם (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניגוד לדיווחים קודמים על כך שיש לעבד שקדים טריים תוך 3 שעות לאחר הניתוח¹⁹, מצאנו שדגימות שקדים טריות יכולות לשמור על כדאיותן כאשר הן מאוחסנות ב-4 מעלות צלזיוס ומעובדות תוך 24 שעות. כדי לייעל את כדאיות התאים מרקמת השקדים בעת ההפשרה מאחסון חנקן נוזלי, אימצנו את שיטת ההפשרה הטיפה המומלצת בריצוף תא בודד, שבו כדאיות תאים גבוהה מוערכת מאוד¹². גישה זו אפשרה התאוששות אופטימלית של תאים חיים בהשוואה לשיטות הפשרה ישירות ומהירות נפוצות (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה למחקר תוך-כיתתי של NIAID, NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>מכונות ומכשירים
3 מ"ל מזרק פלסטיק	BD	309657
96 Well U צלחת תחתונה	Thermo Scientific	163320
1.2 מ"ל בקבוקונים קריוגניים	קורנינג	430487
מסננת תאים 70 ומיקרו; m ניילון	פלקון	352350
צלחת תרבית תאים (60 מ"מ)	VWR	10062-890
צנטריפוגה	תרמו מדעית	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L מדד אמבט מים דיגיטלי		B2000-2
מספריים עדינים - Sharp	FST	14060-11
מארזי מכשירי פלסטיק	FST	20830-05
ציטומטר זרימה ספקטרלית, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
מלקחיים דפוס סטנדרטי	FST	11000-13
מלקחיים דפוס סטנדרטי	FST	11000-20
מנתח כדאיות תאי Blu Vi-cell	בקמן קולטר	C19201
<חזק>ריאגנטים
0.5 מ' EDTA pH 8.0	ביולוגיה איכותית	351-027-101
2-מרקפטואתנול	Gibco	21985-023
מאגר ליזינג ACK	Gibco	A10492-01
תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטרייקוטית (תרחיף פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B, 100x)	Gibco	15240-062
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
מאגר קיבוע ציטופקס	BD	554655
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Sigma	D8418-250 מ"ל
DNAase I	Roche	10104159001
עוברי סרום בקר (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/סט חיץ צביעת גורם שעתוק	eBioscience	00-5523-00
ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP		BD 554724
HEPES (1 מ')	Gibco	15630-080
יונומיצין	סיגמא	I0634-1 מ"ג
L-גלוטמין (200 מ"מ)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
תמיסת פרפורמלדהיד 16%, דרגת EM (PFA)	מיקרוסקופ אלקטרונים Science	15710	לדלל עם PBS
PBS, pH 7.4	Gibco	10010072
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristate 13-אצטט (PMA)	Sigma	P8139-1mg
מיכלי הקפאה מבוקרי קצב	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-גלוטמין)	Gibco	11875-085
נתרן פירובט (100 מ"מ)	Gibco	11360-070
חוסם מונוציטים כתמים אמיתיים	BioLegend	426103
<חזק>חוצצים
תרבית בינונית			10% FBS מומת בחום (VWR), 2 ננומטר גלוטמין, 0.055 מ"מ 2-מרקפטואתנול, 1% פניצילין/ סטרפטומיצין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ"מ HEPES, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ב-RPMI (+L-גלוטמין)מאגר
		FACS	2 מ"מ EDTA ו-2% FBS מומת בחום ב-PBS
מדיום			90% FBS מומת חום ו-10% מאגר
		הפשרה	מאגר כביסה + 0.1 מ"ג/מ"ל DNaseI
מדיום			שקדיםRPMI בתוספת 5% FBS מומת בחום, 10 מ"מ גלוטמין, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 1% תערובת אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B).
חוצץ			RPMI (+L-גלוטמין) בתוספת 10% FBS מומת בחום ו-10 מ"מ HEPES
נוגדנים חזקים>נוגדנים וחומרים אחרים עבור פאנל ציטוקינים
ביוטין אנטי-אנושי CD107a (LAMP-1) נוגדן	BioLegend	328604	2 μ L ב-200 μ L מדיום תרבית מלא לבאר. נוגדן זה נוסף עם תאים במהלך גירוי PMA/יונומיצין.
Live Dead staining	100 μ L לערבב לכל באר
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0.125 μ L ב-100 μ L PBS לבאר.
<חזק>בלוק מונוציטים	50 μ L לערבב לכל באר
חוסם מונוציטים מאגר	BioLegend	426103	5 μ L חוסם מונוציטים True Stain ו-45 μ L מאגר FACS לכל <
בארנוגדנים חזקים>פני השטח עבור פאנל ציטוקינים
תערובת			μ L/באר
אנטי אנושי CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
אנטי אנושי CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
אנטי אנושי CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
אנטי אנושי CXCR5-BV750	BD	747111	1
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385	10
	18 μ תערובת L לבאר לקולטני כימוקין; הוסף מכוון לתאים עם מאגר
<חזק>תערובת נוגדנים אחרים על פני השטח			μ L/באר
אנטי אנושי CD103-BUV661	BD	749993	2.5
אנטי אנושי CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
אנטי אנושי CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
אנטי אנושי CD25-BB515	BD	564467	10
אנטי אנושי CD27- סופר בהיר 436	תרמו	62-0279-42	5
אנטי אנושי CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
אנטי אנושי CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
אנטי אנושי CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
אנטי אנושי CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
אנטי אנושי CD56-BUV737	BD	612766	3.5
אנטי אנושי CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
אנטי אנושי CD69-BUV563	BD	748764	1
אנטי אנושי CD8-BUV805	BD	612889	1.2
אנטי אנושי FAS-BB700	BD	566542	0.6
אנטי אנושי HLA-DR APC-FIRE 750	BioLegend	307658	2
אנטי אנושי PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
אנטי-אנושי-CD45-PerCP	תרמו	MHCD4531	1.2
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385	10
מאגר			61
			112 μ מערבבים L לכל באר עבור נוגדנים אחרים על פני השטח; הוסף ישירות למאגר בלוק המונוציטים (50 μ L) ותערובת קולטני כימוקין (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L בסך הכל לבאר)
<נוגדנים ציטוקינים חזקים>תוך-תאיים לפאנל ציטוקינים			μ L/באר
אנטי אנושי Granzyme B-PE	BD		1
אנטי אנושי IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
אנטי אנושי IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
אנטי אנושי IL2-BV650	BioLegend		500334 3
אנטי אנושי IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
אנטי אנושי IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
אנטי אנושי פרפורין-APC	BioLegend		353312 2.5
אנטי אנושי TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
אנטי-IFN&גמא;-פסיפיק כחול	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD		613013 0.25
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD		566385 10
מאגר חדירות 1x	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L תערובת לבאר)
<נוגדנים חזקים>נוגדנים ואחרים עבור פאנל גורם שעתוק
CD40 נוגדן, אנטי אנושי	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 μ גרם/מ"ל של מדיום תרבית לעבודה ריכוז
<חזק>צביעת מת חי	100 μ L לערבב לכל באר
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0.125 μ L ב-100 μ L PBS לבאר.
חוסם מונוציטים מאגר	BioLegend	426103	5 μ L חוסם מונוציטים True Stain ו-45 μ L מאגר FACS לכל
נוגדנים <חזקים>פני השטח עבור פאנל גורם שעתוק
<חזק>קולטני כימוקין ערבוב			μ L/באר
אנטי אנושי CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
אנטי אנושי CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
אנטי אנושי CXCR5-BV750	BD	747111	1
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385	10
	13 μ תערובת L לכל תערובת
נוגדנים <חזקה>אחרת על פני השטח			μ L/באר
אנטי אנושי 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
אנטי אנושי CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
אנטי אנושי CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
אנטי אנושי CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
אנטי אנושי CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
אנטי אנושי CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
אנטי אנושי CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
אנטי אנושי CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
אנטי אנושי CD40L-PE	BD		557299 15
אנטי אנושי CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
אנטי אנושי CD56-BUV737	BD	612766	3.5
אנטי אנושי CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
אנטי אנושי CD8-BUV805	BD	612889	1.2
אנטי אנושי HLA-DR APC-FIRE 750	BioLegend	307658	2
אנטי אנושי ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
אנטי אנושי OX40-APC	BioLegend	350008	5
אנטי אנושי PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
אנטי-אנושי-CD45-PerCP	תרמו	MHCD4531	1.2
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385	10
מאגר			54.1
			117 μ מערבבים L לכל באר עבור נוגדנים אחרים על פני השטח; הוסף ישירות לבלוק המונוציטים חוצץ (50 μ L) ותערובת קולטני כימוקין (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L בסך הכל לבאר)
<נוגדנים חזקים>פקטור שעתוק לפאנל גורם שעתוק	μ L/באר
אנטי אנושי T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
אנטי אנושי Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
אנטי אנושי FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
אנטי אנושי GATA3-BB700	BD	566642	2
אנטי אנושי Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
אנטי אנושי Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
מאגר כתמים מבריק פלוס (RUO)	BD	566385
10 1 x מאגר פרמיביליזציה	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mix לכל באר
<חזק>תוכנה וחבילות לניתוח לא מפוקח
	<חזק>תוכנה/חבילה	<חזק>גרסה<	חזק>מקור
1	data.table	1.16.2	רשת ארכיון R המקיפה
2	FlowJO	10.9.0	Becton, דיקינסון ושות'
3	pheatmap	1.0.12	רשת ארכיון R המקיפה
4	R	4.3.2	רשת ארכיון R המקיפה
5	readxl	1.4.3	רשת ארכיון R המקיפה
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	רשת ארכיון R המקיפה
8	SeuratData	0.2.2.9001	רשת ארכיון R המקיפה
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	רשת ארכיון R המקיפה
11	viridis	0.6.5	רשת ארכיון R המקיפה

הקפאה DMSO כביסה < קולטני כימוקין בלוק מונוציטים FACS 561142 FACS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vitro PP2A B

עיבוד יעיל של תאי עזר זקיקי T שקדים וניתוח פונקציונלי באמצעות ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים