מאמר שיטה

ריצוף RNA חד-תאי לפרופיל קטעי מעי הגס הגנגליוני והאגנגליוני של מטופלים עם מחלת הירשספרונג

DOI:

10.3791/69825

⸱

22 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תהליך ריצוף RNA חד-תאי לניתוח חדירת תאי חיסון והבדלים ייחודיים בין מקטעי המעי הגס הגנגליוני והאגנגליוניים במחלת הירשספרונג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת הירשפרונג (HSCR) היא הפרעת תנועתיות מולדת במעי, המתאפיינת בהיעדר נוירונים מעיים במעי הרחוק. בהשוואה לריצוף RNA בכמויות גדולות, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מאפשר פרופיל ביטוי גנים ברמת תא יחיד, ובכך פותר הטרוגניות תאית שמוסתרת בניתוחים ממוצעים לאוכלוסייה. הוקם תהליך סטנדרטי של scRNA-seq לאפיון הנוף השעתוקי של מקטעים גנגליוניים ואגנגליוניים של מטופלים עם HSCR. נאספו רקמות המעי הגס, ובוצעו צביעות המטוקסילין ואאוזין לזיהוי אזורים גנגליוניים ואגנגליוניים. רקמות פורקו אנזימטית ומכאנית לתליות חד-תאיות, ולאחר מכן בוצעו סינון, הערכת כדאיות ובניית ספריות טרנסקריפטום חד-תא. ספריות שעברו בקרת איכות סודרו, ונתונים גולמיים עובדו לכימות תאים וסינון איכות להסרת תאים באיכות נמוכה ופריטים טכניים. לאחר נירמול והפחתת ממדיות, התאים אוחדו והועברו על פי גנים של סמנים מבוססים. ניתוחים בהמשך השוו את הרכב סוגי התאים בין רקמות גנגליון לאג'נגליון וזהו גנים מבוטאים באופן שונה בתוך תת-קבוצות מפתח של תאי החיסון. התוצאות חושפות הבדלים משמעותיים במיקרו-סביבה החיסונית בין הקטעים הגנגליוניים והאגנגליוניים ב-HSCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת הירשפרונג (HSCR) היא אחת מהפרעות תנועתיות המעי המולדות הנפוצות ביותר, עם שכיחות של כ-1 מתוך 5,000 לידות חיות ברחבי העולם1. המחלה נובעת מכישלון של תאי הקצה העצבי (ENCCs) להגר למעי הדיסטלי במהלך שבועות עובריים 5–12, מה שמוביל להיעדר גנגליונים מעיים במקטעים שנפגעו2. כתוצאה מכך, הקטע האגנגליוני מציג התכווצות ספסטית מתמשכת ופריסטלזה פגועה, מה שמוביל להרחבת מעי פרוקסימלית. קלינית, זה מתבטא בחסימה פונקציונלית, הגורמת לעצירות, נפיחות בטן והקאה, ועלול להיות מסכן חיים במקרים חמורים. כריתה כירורגית של קטע האגנגליון נותרה הטיפול העיקרי ל-HSCR; עם זאת, אחוז משמעותי מהמטופלים חווים סיבוכים לאחר ניתוח, כולל עצירות, דלקת מעיים והלכלוך בצואה, מה שפוגע משמעותית באיכות החיים3. בנוסף, תסמונת המעי הקצר (SBS) עלולה להתרחש לאחר כריתה נרחבת של המעיים, מה שעלול לגרום לפגיעה בספיגת חומרים מזינים ולהגברת האתגרים בניהול קליני. לכן, הבהרת המנגנונים הבסיסיים של HSCR וזיהוי מטרות טיפוליות חדשות נותרות צרכים קליניים קריטיים.

בשנים האחרונות, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מיושם באופן נרחב לחקר מנגנונים מולקולריים הקשורים למחלות. בניגוד לריצוף RNA בנפח קונבנציונלי, scRNA-seq מאפשר ניתוח ביטוי גנים ברזולוציית תא יחיד, ומאפשר זיהוי הטרוגניות תאית ותת-אוכלוסיות נדירות שמוסתרות בניתוחים גדולים4. כתוצאה מכך, scRNA-seq הפך לכלי עוצמתי לניתוח הטרוגניות תאית ותקשורת בין-תאית, ומקדם מחקר בביולוגיה וברפואה5. גישה זו חשפה מנגנונים פתוגניים חדשים ומטרות טיפוליות במחלות מורכבות, כולל מחלת אלצהיימר6, דלקת מפרקים שגרונית7, סרטן ריאות8 וסוכרת סוג2 9.

במחקר זה, scRNA-seq יושם לאפיון נוף השעתוק של תאי החיסון ודפוסי חדירה ברקמות המעי הגס הגנגליוניות והאגנגליוניות של מטופלים עם HSCR. תהליך העבודה כלל שלושה שלבים עיקריים: הכנה והערכת איכות של מתלים חד-תאיים, בניית ספריות RNA-seq חד-תאיות באורך 3′, וניתוח ביואינפורמטי במורד הזרם. דגימות הרקמה נשמרו בתמיסת שימור חד-תאית ייעודית מיד לאחר הכריתה ופורקו אנזימטית לתלשות תא בודדות בתוך 48 שעות. חיוניות התאים עלתה על 80%, והריכוז הסופי של התאים הותאם ל-700–1,500 תאים/מיקרוליטר לפני הכנת הספרייה. הושוו חדירת תאי חיסון בין מקטעים גנגליוניים לאגנגליוניים, וזוהו תתי-אוכלוסיות תאי חיסון עם הבדלים בולטים בתעתוק. ניתוחים אלו מגדירים שינויים בתאי החיסון הקשורים לפתולוגיה של המעי הגס ב-HSCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים המסונף של אוניברסיטת זוני לרפואה (מס' אישור: KYLL-2024-030). המחקר עומד בהצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת (בעל פה ובכתב) התקבלה מכל המשתתפים ומהאפוטרופוסים שלהם. טבלה 1 מציגה את המידע על מטופלי HSCR.

לאסוף רקמות מעי הגס, כולל מקטעים גנגליוניים ואגנגליוניים, מחולי HSCR שאובחנו ועברו ניתוח במחלקה לכירורגיית ילדים בבית החולים המסונף של אוניברסיטת הרפואה זוני. כלול מקטעים גנגליוניים ואגנגליון משני גברים עם חולי HSCR. מידע קליני מפורט מסופק בטבלה 1. כל המגבים, הכימיקלים, הציוד והתוכנה מופיעים בטבלת החומרים.

1. צביעת המטוקסילין ואאוזין

  1. איסוף וקיבוע רקמות
    1. קיבעו דגימות רקמת מעי בתמיסת קיבוע פאראפורמלדהיד 4% למשך לפחות 24 שעות.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ומשחרר אדי פורמלדהיד. בצע את כל ההליכים במכסה אדים כימי והשתמש בציוד מגן אישי מתאים.
    2. גזמו את הרקמות לכ-5 × 5 × 2 מ"מ 3 באמצעות סכין מנתח. הניחו טישו בתוך קלטות משולבות ושוטפים במי ברז זורמים במשך 24 שעות.
      הערה: הסר את קצוות הרקמה והכין בלוקים עם לפחות משטח שטוח אחד. אם לא אחיד, הניחו טישו בין ניירות סינון לאחר השטיפה.
  2. ייבוש אתנול מדורג
    1. טבלו את הרקמות ברצף בתמיסות אתנול: 70% אתנול ללילה, 80% אתנול ל-3 שעות, 90% אתנול ל-2 שעות, 95% אתנול I לשעתיים, 95% אתנול II לשעה אחת, 100% אתנול I לשעה, ו-100% אתנול II למשך 30 דקות.
      הערה: מדלל אתנול (≥99.7%) עם מים אולטרה-טהורים לריכוזים המצוינים.
      אזהרה: בצע טיפול באתנול במכסה אדים כימי.
    2. הסר את סל ההתייבשות ונקז היטב בין השלבים.
  3. פינוי
    1. העבר רקמות לקסילן למשך 30 שניות כדי להשיג שקיפות.
  4. חדירה והטמעה של פרפינים
    1. המיס שעוות פרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס יום אחד מראש. הכניסו שעווה טרייה לשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי להסיר בועות. סנן את הפרפין המומס דרך נייר סינון אחרי המחזור השלישי.
    2. לחדור רקמות לשעוות פרפין טהורה (שעוות פרפין I) למשך שעה.
    3. חדירת רקמות בתערובת פרפין (שעוות פרפין II; שעוות פרפין טהורה: שעוות דבורים = 8:1) למשך 2 שעות.
      הערה: להמיס לגמרי את שעוות הדבורים ולסנן לפני השימוש.
    4. שפוך שעוות פרפין II לתבניות הטמעות. הנח בלוקי רקמה זקופים ושטוחים, הכנס תוויות ותן להם להתמצקות.
  5. חלוקה
    1. גזם בלוקי פרפין כדי לקבל משטחים חלקים מבלי לחתוך את הרקמה.
    2. התקן בלוקים על מיקרוטום. כוון את הכיוון והסר את הפרפין העודף. חתכו חתכים סדרתיים בעובי 4 מיקרון. העברו מקטעי ציפה על אמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס והעבירו למגלשות זכוכית.
    3. החלקות יבשות בתנור של 60 מעלות צלזיוס כדי להסיר לחות שנותרה.
      הערה: חתכים יבשים למשך 12–48 שעות.
  6. דה-פראפיניזציה
    1. לבצע דגירה רציפה: קסילן I (15 דקות), קסילן II (15 דקות), 100% אתנול I (5 דקות), 100% אתנול II (5 דקות), 90% אתנול (5 דקות), 80% אתנול (5 דקות), 70% אתנול (5 דקות) ומים מזוקקים (5 דקות).
  7. צביעת המטוקסילין
    1. צבעי חלקים עם המטוקסילין למשך 50 שניות.
    2. שטוף תחת מים זורמים מהברז למשך 10 דקות.
  8. צביעת אאוזין
    1. צבע קטעי אאוזין במשך 40 שניות.
  9. התייבשות
    1. טבלו חלקים ברצף ב-95% אתנול I (30 שניות), 95% אתנול II (30 שניות), 100% אתנול I (30 שניות), ו-100% אתנול II (30 שניות).
  10. פינוי
    1. העבר חלקים לקסילן I ל-10 דקות ול-Xylen II ל-10 דקות.
  11. התקנה ותצפית
    1. הוסיפו מדיום התקנה. כסה עם כיסוי זכוכית והסר בועות אוויר.
    2. תן למדיום ההרכבה להתגבש. בדוק חלקים תחת מיקרוסקופ אור.

2. ריצוף RNA חד-תאלי

  1. הכנת תלייה חד-תאית
    1. טחון רקמות מעיים לחתיכות בגודל ~1 מ"מ3 באמצעות מספריים.
    2. דגרו קטעי רקמה במדיום הנשר המותאם (DMEM) של דולבקו המכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז II ו-0.1 מ"ג/מ"ל DNase I בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה (60 סל"ד).
    3. סיימו את העיכול על ידי הוספת כמות שווה של DMEM קר המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
    4. מסנן את המתלים דרך מסננת תא 70 מיקרון. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על כדור התא. שטוף פעם אחת עם סליין בופר עם פספט (PBS) המכיל 0.04% אלבומין סרום בקר (BSA).
    6. הפרדת גושים של תאים על ידי פיפטציה עדינה כדי לקבל תלייה חד-תאית.
    7. סנן את המתלה דרך מסננת תא 40 מיקרון.
    8. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט ואסף את הכדור.
    9. החזירו תאים ב-DMEM המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין (P/S).
    10. קבעו את הקיימות והצפיפות של התאים באמצעות הדרת כחול טרייפן. השתמש בדגימות עם כדאיות >80% וכיוון את הריכוז ל-700–1,500 תאים/מיקרוליטר.
      הערה: מערבבים תאי השעיה עם Trypan Blue (1:1) וספרו תאים בריאים באמצעות המוציטומטר.
  2. הכנה לספרייה
    1. טעין כ-15,000 תאים בכל ריצה להכנת הספרייה.
      הערה: במיקרוטיפות ג'ל-חרוז-באמולסיה (GEM), mRNA מתחבר לאוליגונוקלאוטידים פולי(dT) על חרוזי ג'ל.
    2. לבצע שעתוק הפוך והגברת cDNA באמצעות PCR (95 מעלות צלזיוס ל-10 דקות; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-35 שניות, 72 מעלות צלזיוס ל-25 שניות; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס ל-25 שניות). השתמש ב-cDNA מוגבר לבניית ספריית scRNA-seq של 3′.
      הערה: בליטה של CCC מתווספת במהלך סינתזת cDNA ומשתלבת עם רצף החלפת התבנית (TSO).
    3. לשבור אמולסיות ולשחזר cDNA מ-GEMs.
  3. בקרת איכות ספרייה ורצף
    1. כימות ביטוי גנים והערכת התפלגות גודל המקטעים.
    2. בצע כימות מדויק באמצעות מכשיר qPCR פלואורסצנטי.
      הערה: ודא ריכוז ספרייה ≥10 ננומטר.
    3. ספריות רצף המשתמשות בכלי ריצוף.
      הערה: מבנה קריאה: Read 1 (26 bp), Read 2 (91 bp), מדד i7 (8 bp); עומק יעד ~50,000 קריאות לתא.
  4. בקרת איכות נתונים
    1. יישר את הקריאות הגולמיות למסד הנתונים של ההפניות. בצע ספירת UMI ויצירת מטריצה תא-ג'ן.
    2. ייבוא תוצאות בפורמט AnnData (נתונים מוערים) לניתוח במורד הזרם.
    3. בצע סינון בקרת איכות בהתבסס על UMIs, ספירת גנים וקריאות מיטוכונדריאליות.
      הערה: הסרת כפילים (Scrublet); להוציא תאים עם <200 או >5,000 גנים, total_counts >40,000, או mt_ratio >20%.
  5. הפחתת ממדיות והערות
    1. נרמול מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) מספר עד 10,000 לתא.
    2. לזהות גנים משתנים מאוד.
    3. לבצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA).
    4. בנו גרף שכן קרוב ל-k.
    5. בצע הטמעה של UMAP.
    6. תאי אשכול באמצעות אלגוריתם ליידן ב-Scanpy (v1.9.3).
      הערה: השתמש ב-sc.pp.neighbors וב-sc.tl.leiden (רזולוציה = 0.5).
    7. הערות על סוגי תאים באמצעות כלי שנועד לסימון אוטומטי ומדויק של סוגי תאים בנתוני ריצוף RNA תא יחיד (scRNA-seq).
  6. ניתוח דיפרנציאלי
    1. לבצע ניתוח ביטוי גנים שונה ב-R (גרסה 4.2.2) באמצעות Seurat (גרסה 4.3.0).
      הערה: השתמש בפונקציית FindMarkers עם מבחן סכום הדרגה של וילקוקסון.
    2. בצע ניתוח העשרת GO באמצעות clusterProfiler (v4.8.1) עם enrichGO.
      הערה: כולל קטגוריות CC, MF ו-BP.
    3. בצע ניתוח העשרת מסלול KEGG באמצעות clusterProfiler (v4.8.1) עם enrichKEGG10.

3. סילוק פסולת

  1. איסוף פסולת המכילה פאראפורמלדהיד וקסילן בנפרד.
  2. לנטרל תמיסות חומציות כשמתאים או להשליך אותן כפסולת מסוכנת.
  3. פעלו לפי תקנות הבריאות והבטיחות הסביבתית המוסדית (EHS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) (איור 1) חשפו הבדלים היסטולוגיים ברורים בין מקטעים גנגליוניים לאגאנגליוניים. בהשוואה למקטעים גנגליוניים, מקטעים אגנגליוניים הציגו קילוף מוגבר ברירית, ירידה משמעותית בתאי הגביע ובנוירונים תת-ריריים, וטשטוש הגבולות בין שכבות הריריות לשריריות. בתת-קבוצה של חתכים, שימור הרקמות היה לא אופטימלי, עם היפרדות אפיתל חלקית והפרעה בארכיטקטורת הרקמה, שהגבילו את ההערכה ההיסטולוגית באזורים אלו.

לאחר סינון בקרת איכות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריצוף RNA חד-תאי יושם על פרופיל תכונות שעתוק של רקמות מעי גס שנלקחו בניתוח (מקטעים גנגליונים ואגנגליוניים) של חולים עם מחלות הירשפרונג 4,5. הושם דגש מיוחד על אסטרטגיית דיסוציאציה של רקמות, שכן פרמטרי הפרידה משפיעים על התאוששות תאים, ייצוג סוג תא ושלמות ה-RNA. תנאי העיכול האנזימטיים הותאמו לאיזון דיסוציאציה מספקת של רקמות לבין שימור חיוניות התא ואיכות הטרנסקריפטומית. בהינתן המטריצה החוץ-תאית הצפופה והארכיטקטורה המורכבת של רקמות המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המדע והטכנולוגיה של גוויז'ואו (קרן שיתוף המדע והטכנולוגיה של גוויז'ואו - ZK - [2024] General 344) (ל-X.F. יאנג) וחוזה פרויקט המדע והטכנולוגיה של זוני (שיתוף פעולה במדע וטכנולוגיה) (שיתוף פעולה מדעי וטכנולוגי של זוני HZ (2023) מס' (ל-Y. Qu).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שעוות דבוריםSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
שעוות דבוריםSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
אלבומין סרום בקרתרמופישר30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? CID=srch-srp-30066575
אלבומין סרום בקרתרמופישר30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? CID=srch-srp-30066575
CellTypistלא זמיןNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
CellTypistלא זמיןNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
חבילת פרופיילר אשכולביו-קונדוקטורv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
חבילת פרופיילר אשכולביו-קונדוקטורv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
קולגנאז IIתרמופישר17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
קולגנאז IIתרמופישר17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
זכוכית כיסויCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
זכוכית כיסויCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
להב מיקרוטום חד-פעמינוצהS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
להב מיקרוטום חד-פעמינוצהS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase Iתרמופישר18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
DNase Iתרמופישר18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
תנור ייבושבורוקDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
תנור ייבושבורוקDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
דולבקו' S Modified Eagle Mediumתרמופישר12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
דולבקו' S Modified Eagle Mediumתרמופישר12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
אלכוהול אתיליSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
אלכוהול אתיליSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
סרום בקר עובריתרמופישרA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
סרום בקר עובריתרמופישרA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
ערכת צביעת המטוקסילין ואאוזיןביוטייםC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
ערכת צביעת המטוקסילין ואאוזיןביוטייםC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
חומצה הידרוכלוריתSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
חומצה הידרוכלוריתSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
שקופית מיקרוסקופCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
שקופית מיקרוסקופCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
מדיום הרכבהביוטייםC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& קוד=C0173-100ml
מדיום הרכבהביוטייםC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& קוד=C0173-100ml
מיקרוסקופ אופטיניקוןECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
מיקרוסקופ אופטיניקוןECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
שעוות פרפין Sinopharm Chemical Regain Co., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
שעוות פרפין Sinopharm Chemical Regain Co., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Paraformaldehyde Fix SolutionביוטייםP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Paraformaldehyde Fix SolutionביוטייםP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
פניצילין– סטרפטומיציןתרמופישר15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
פניצילין– סטרפטומיציןתרמופישר15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
סליין ממוגן בפוספטתרמופישר10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
סליין ממוגן בפוספטתרמופישר10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
נייר פילטר איכותיסולרביולוגיהYA0166https://www.solarbio.com
נייר פילטר איכותיסולרביולוגיהYA0166https://www.solarbio.com
חבילת תוכנה Rקרן R למחשוב סטטיסטיv4.2.2https://www.r-project.org/
חבילת תוכנה Rקרן R למחשוב סטטיסטיv4.2.2https://www.r-project.org/
מיקרוטום סיבובילייקהLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
מיקרוטום סיבובילייקהLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
סקנפיפיתוח קהילתיv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
סקנפיפיתוח קהילתיv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
סוראטקראןv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
סוראטקראןv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
מייבש רקמותווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקס בע"מJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
מייבש רקמותווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקס בע"מJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
מכונת הטמעת רקמותווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקס בע"מJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
מכונת הטמעת רקמותווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקס בע"מJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
כחול טרייפן סולרביולוגיהC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
כחול טרייפן סולרביולוגיהC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
קסילןSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
קסילןSinopharm Chemical Regain Co., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montalva, L., et al. Hirschsprung disease. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 54 (2023).
  2. Morera, C., Nurko, S. Hirschsprung's disease management. Aliment Pharmacol Ther. 60 Suppl 1, S66-S76 (2024).
  3. Kyrklund, K., et al. ERNICA guidelines for the management of rectosigmoid Hirschsprung's disease. Orphanet J Rare Dis. 15 (1), 164 (2020).
  4. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
  5. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970 (2023).
  6. Mathys, H., et al. Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease. Nature. 632 (8026), 858-868 (2024).
  7. Wu, X., et al. Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis. Nat Commun. 12 (1), 4977 (2021).
  8. Maynard, A., et al. Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Cell. 182 (5), 1232-1251.e22 (2020).
  9. Lee, H., et al. Immunological link between periodontitis and type 2 diabetes deciphered by single-cell RNA analysis. Clin Transl Med. 13 (12), e1503 (2023).
  10. Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
  11. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient culture of human naive and memory B cells for use as APCs. J Immunol. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  12. Cancro, M. P., Tomayko, M. M. Memory B cells and plasma cells: the differentiative continuum of humoral immunity. Immunol Rev. 303 (1), 72-82 (2021).
  13. Weisel, N. M., et al. Surface phenotypes of naive and memory B cells in mouse and human tissues. Nat Immunol. 23 (1), 135-145 (2022).
  14. Phelps, A., et al. Production and use of antigen tetramers to study antigen-specific B cells. Nat Protoc. 19 (3), 727-751 (2024).
  15. Wu, X. Z., et al. Activated naive B cells promote development of malignant pleural effusion by differential regulation of Th1 and Th17 response. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 315 (3), L443-L455 (2018).
  16. Chien, C. H., Chiang, B. L. Regulatory T cells induced by B cells: a novel subpopulation of regulatory T cells. J Biomed Sci. 24 (1), 86 (2017).
  17. Tan, Z., et al. Comprehensive analysis of scRNA-seq and bulk RNA-seq reveals dynamic changes in the tumor immune microenvironment of bladder cancer and establishes a prognostic model. J Transl Med. 21 (1), 223 (2023).
  18. Ding, Q., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq, bulk RNA-seq, Mendelian randomization, and eQTL reveals T cell-related nomogram model and subtype classification in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 15, 1399856 (2024).
  19. Guo, S., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq unravels T cell-related prognostic risk model and tumor immune microenvironment modulation in triple-negative breast cancer. Comput Biol Med. 161, 107066 (2023).
  20. Zhang, C., et al. Comprehensive analyses of brain cell communications based on multiple scRNA-seq and snRNA-seq datasets for revealing novel mechanisms in neurodegenerative diseases. CNS Neurosci Ther. 29 (10), 2775-2786 (2023).
  21. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 81 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים