מאמר מחקר

השוואת תוצאות ניתוח DNA של זרע באמצעות אסטרטגיות גייטינג שונות בציטומטריית זרימה

DOI:

10.3791/70417

⸱

10 ביולי 2026

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שער פוליגונלי (PGG) ושער צולב (CFG) הם שיטות זרימה-ציטומטריה לזיהוי שלמות DNA של הזרע. PGG מודד את מדד פיצול ה-DNA (DFI) ואת מדד צביעת ה-DNA הגבוה (HDS). CFG מדווח על DFI חמור, DFI קל, ו-DFI כללי. מחקר זה נועד להשוות בין התוצאות והקורלציות ביניהן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלמות ה-DNA של הזרע היא גורם מרכזי בהבטחת הפריה מוצלחת, התפתחות עוברים והריון מתמשך. הערכת מבנה כרומטין הזרע (SCSA) באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר דנאטורציה של DNA וצביעת כתום אקרידין נחשבת לשיטה הסטנדרטית להערכת DNA של זרע. שתי אסטרטגיות גייטינג להערכה מבוססת ציטומטריית זרימה של מדד פיצול DNA (DFI) דווחו בספרות: שער פוליגונלי (PGG) וגיטינג צלב (CFG). מטרת המחקר הנוכחי הייתה להשוות את הקשרים בין תוצאות הבדיקה בין PGG ל-CFG, ולנתח את המתאמים שלהם עם פרמטרים של ניתוח זרע בסיסי. הנתונים שהושגו באופן עצמאי בשתי השיטות הושוו באמצעות ניתוח סטטיסטי, כולל גרפים של בלנד-אלטמן וניתוח רגרסיה. בסך הכל נבחרו 121 גברים שעברו הערכת פוריות במרכז הרבייה של בית החולים שלנו באמצעות שיטת דגימה אקראית לחלוטין. DFI של זרע ואינדיקטורים קשורים זוהו באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות PGG ו-CFG, בהתאמה. התוצאות הראו שערכי DFI שהתקבלו משתי השיטות הראו התאמה טובה. מקדמי המתאם בין DFIp משיטת PGG לבין DFIm, DFIs ו-DFIc בשיטת CFG היו 0.6497, 0.9404 ו-0.9667, בהתאמה (כל p < 0.01). מדד צביעת DNA גבוה (HDS) הראה מתאם שלילי קל עם DFIs (r = -0.3042, p < 0.05). אחוז הזרע הנייד ההדרגתי היה במתאם שלילי עם DFIp, DFIs ו-DFIc (r = -0.3824, -0.3794, -0.3574, בהתאמה, כולם p < 0.05). לא נצפה קשר מובהק בין HDS לנפח הזרע, ריכוז הזרע, סך כל הזרע או PR (%). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-DFIs קשורים יותר לפוריות גברית, מה שמרמז כי שיטת CFG, שמספקת פרמטר זה, עשויה להתאים יותר להערכה קלינית של נזק DNA לזרע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלמות ה-DNA של הזרע מתייחסת לשלמות וליציבות התפקודית של המבנה המולקולרי של ה-DNA בגרעין הזרע. במיוחד, הוא מאופיין במבנה כרומטין תקין, רצפי בסיס שלמים ללא נזק חמצוני או שבר, ויכולת להעביר מידע גנטי במדויק לצאצאים. במהלך תאי זרע, כאשר הלחץ החמצוני עולה1, שינוי הכרומטין אינו תקין2, או שהזרע מושפע מרעלניםסביבתיים 3, שלמות ה-DNA של הזרע תיפגע, מה שמוביל לאי-התאמה בסיסית, אובדן, שינוי, הוספת DNA וקישור צולב, שבירות חד-גדיליות וכפולות ועוד. יתרה מזאת, DNA זרע פגום עלול לפגוע בפוריות הגברית ולהשפיע לרעה על תוצאות ההריון בטכנולוגיית רבייה מסייעת (ART)4, ובמקביל להגדיל את הסיכון לאובדן הריון חוזר5. בשנת 2021, האגודה האירופית לאורולוגיה (EAU) המליצה על הכללת בדיקות DFIבמערכת הערכת פוריות גברית.

נכון להיום, שלמות ה-DNA של הזרע מוערכת בעיקר על ידי זיהוי מדד פיצול DNA של הזרע (DFI). בדיקת מבנה כרומטין הזרע (SCSA) באמצעות ציטומטריית זרימה היא השיטה העיקרית להערכת DFI7. שתי שיטות לזיהוי DFI בזרע דווחו בספרות. אחד מהם הוא שיטת השער הפוליגונלי (PGG), שיכולה לדווח בו זמנית על שני מדדים מרכזיים, כגון DFI זרע ו-HDS8. PGG היא גישה קלאסית של SCSA המתאפיינת במקדם זיהוי קטן יותר של שונות וחזרתיות עליונה9. עם זאת, הוא אינו יכול להבחין בין חומרת נזק ה-DNA. סוג נוסף הוא שיטת השער הצולבי (CFG), שיכולה לדווח על סמן נזק חמור של DNA זרע (DFIs), סמן נזק קל של DNA זרע (DFIm), ו-DFI כולל של שיטת השער הצולבת (DFIc). DFIc שווה לסכום של DFIs ו-DFIm. בהשוואה לטכנולוגיות הנוכחיות להערכת שלמות DNA הזרע, שיטת CFG יכולה לשקף את חומרת נזק DNA הזרע10.

כדי לקבוע איזו שיטה מתאימה יותר להערכת איכות הזרע, מחקר זה השתמש הן בשיטת PGG והן בשיטת CFG למדידת DFI ופרמטרים קשורים בזרע. הושווה המתאם בין תוצאות שתי השיטות הללו לבין פרמטרי ניתוח זרע קונבנציונליים. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון שמנתח את הקשר בין תוצאות הגילוי בין שתי המתודולוגיות, PGG ו-CFG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הראשון של חואיאן באוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה (מספר אישור: KY-2024-181-01). הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שדגימות המחקר שימשו בהן השתמשו. דיאגרמת סכמטית כוללת של תהליך העבודה המוצגת באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד בהם השתמשו מפורטים בטבלת החומרים.

הגדרות CFG עבור ציטומטר הזרימה
לאחר טיפול חומצי, הכרומטין הגרעיני של זרע עם DNA פגום מציג DNA חד-גדילי, בעוד הכרומטין הגרעיני של זרע עם DNA לא פגוע שומר על מבנה כפול גדילי שלם. הצבע הפלואורסצנטי אקרידין אורנג' (AO) נקשר ל-DNA חד-גדילי ופולט פלואורסצנציה אדומה כאשר הוא מעורר על ידי לייזר של 488 ננומטר. כאשר הוא קשור ל-DNA כפול-גדילי, הוא פולט פלואורסצנציה ירוקה כאשר הוא מעורר על ידי לייזר של 488 ננומטר. בהתבסס על מספר אותות הפלואורסצנציה האדומים והירוקים שנלכדים על ידי ציטומטר הזרימה, מחושב היחס בין הפלואורסצנציה האדומה לסך הפלואורסצנציה האדומה והירוקה, המייצג את DFI של הזרע.

הגדרות ה-CFG יושמו לפי הסקירה שסיפקו יאנג ואחרים. ציטומטר הזרימה צריך להיות מוגדר באמצעות הפלואורסצנציה הירוקה הנמוכה ביותר והפלואורסצנציה האדומה הגבוהה ביותר הנמדדת בזרע נורמלי עם צבועות AO כהפניות גבול (איור 2). להלן רשימת המאפיינים התאיים של כל רבע ב-CFG:
רבע Q1 מעיד על זרע תקין. נצפה כי ה-DNA של הזרע היה שלם, וכמות הקישור של AO הייתה מינימלית, מה שהוביל לפלואורסצנציה ירוקה.
זרעים ברבעון Q2 בעלי DNA מפורק חלקית ונראים כתומים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. DNA כזה עשוי להיות ניתן לתיקון, אך זרעים אלו מסווגים כבעלי פיצול DNA קל (DFIm)10.
רבע Q3 מוגדר כפלואורסצנציה הלא-ספציפית שעברה חיסור.
הזרע ברבעון Q4 מכיל DNA מפורק ונראים אדומים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מה שמעיד על פיצול DNA חמור (DFIs).

מוצע כי זרעים ברבעים Q2 ו-Q4 מכילים DNA מפורק, וסכום מוגדר כ-DFIc.

הגדרות ה-PGG עבור ציטומטר הזרימה
השער הפוליגונלי לניתוח ציטומטרי זרימה הוקם לפי השיטה שתוארה על ידי אבנסון ואחרים. כפי שמוצג באיור 3, המאפיינים התאיים הקשורים לכל שער הם כדלקמן:
P3 מעיד על אחוז התאים עם DNA מנותק.
P4 מייצג זרע עם צביעות DNA גבוהה (HDS). קבוצת הזרע הזו חסרה את ההחלפה הרגילה בין היסטון לפרוטמין.
אוכלוסיות התאים הדומיננטיות הממוקמות מחוץ לשערי P3 ו-P4 מורכבות מזרע תקינים, עם הפלואורסצנציה האדומה מופחתת ופולטת פלואורסצנציה ירוקה ברובה.

איסוף וניתוח דגימות זרע
כל 121 דגימות הזרע היו מהגברים שביקרו במרכז הרבייה של בית החולים הראשון חואיאן, המסונף לאוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה. דגימות זרע נאספו על ידי אוננות לאחר תקופה של 2-7 ימים של הימנעות. ניתוח זרע שגרתי בוצע בקפדנות בהתאם לדרישות מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי לבדיקה ועיבוד זרע אנושי11,12. ניתוחי ריכוז ותנועתיות זרע בוצעו באמצעות מערכת ניתוח זרע ממוחשבת (CASA). כל דגימה נותחה פעמיים. התוצאות דווחו כממוצע רק כאשר ההפרש בין שתי התוצאות היה בטווח הביטחון של 95%; אחרת, בוצעו דגימה מחדש וניתוח.

ניתוח DFI
חשב את נפח הדגימה הנדרש לדגימת הזרע כך שהריכוז הסופי של זרע בתגובת A מערכת ציטומטריית הזרימה הוא 2–3 x 106/מ"ל. שיטת החישוב: בהנחה שריכוז הזרע בדגימת הזרע המקורית הוא M x 106/מ"ל, אז נפח הזרע הנדרש (μL) = 150/M. מוסיפים את נפח הזרע המחושב לצינור ציטומטר זרימה, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של תגובת A ומערבבים בעדינות. הוסף 100 מיקרוליטר של תגובת B, ערבב בעדינות, ודגרה במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. מיד הוסיפו 300 מיקרול של תגובת C וערבבו בעדינות. לזהות את הדגימה באמצעות CFG ו-PGG על ציטומטר הזרימה, ולנתח לפחות 5000 תאי זרע.

ניתוח סטטיסטי
הנתונים עברו ניתוח סטטיסטי באמצעות GraphPad Prism 6.0. גרפים של בלנד-אלטמן נבנו כדי להעריך את רמת ההסכמה בין PGG ל-CFG על ידי חישוב הממוצע וההבדלים. ההבדלים בין שתי השיטות הוערכו מול הערכים הממוצעים שלהן. יתרה מזאת, שיטת פירסון שימשה לניתוח המתאם בין PGG ל-CFG. נקבע כי ערך p קטן מ-0.05 הוא מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבין 121 המשתתפים במחקר (גיל ממוצע: 32.5 ± 4.9 שנים; טווח: 26–44 שנים), 28 אובחנו עם אסתנוזוספרמיה ו-4 עם אוליגוזוספרמיה. מאפייני דמוגרפיה בסיסיים ופרמטרי ניתוח זרע מסוכמים בטבלה 1.

כפי שמודגם באיור 4, תרשים בלנד-אלטמן חשף כי תוצאות DFI של הזרע שהושגו בשיטות PGG ו-CFG הציגו עקביות מצוינת (r = 0.9667, p = 0.0000). רק שני מדגמים הראו פערים מעל +10%, ושלושה דגימות הראו פערים קטנים מ-10% בלבד, כאשר היחסים היו 1.7% ו-2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המהדורה השישית של מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי לבדיקה ועיבוד זרע אנושי12 ממליצה על ארבע שיטות להערכת שלמות DNA של הזרע: תיוג סופי של דקסינוקלאוטידיל טרנספראז (dUTP), תיוג קצה קצה (TUNEL), בדיקות אלקטרופורזה ג'ל חד-תאית (Comet), SCSA, ובדיקת פיזור כרומטין זרע (SCD). מבין אלה, SCSA אומץ באופן נרחב במעבדות אנדרולוגיה בזכות השימוש שלו בזרימת ציטומטריה לניתוח, המציע תפוקה גבוהה, יעילות ואובייקטיביות, וכן יכולת לדווח בו-זמנית על פרמטרים כמו DFI ו-HDS

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מְעַרְכֶת אֲנָלִיזָה מְסוּייעַת חוּשׁבִית של זרעBeijing Suijia Software Co., LtdSA-II 
צִיטוֹמֶטֶר זְרוּעָה Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdCyto E6
ערכת צִיטוֹמֶטֶר זְרוּעָהShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
תַאי סְפִּירָה מקלרSefi Medical Instruments
ערכת שלמות DNA של גרעין הזרעShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD-

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233JoVE

מאמרים קשורים