פלטפורמת אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית לעריכת גנום CRISPR בקלט נמוך וטרנספקציה של mRNA בתאי T תלוי-תלת-ממדיים ובמודלים של תאי תלת-ממד

סיכום

פרוטוקול זה מתאר עריכת גנום CRISPR–Cas9 מוקטנת של קולטן TCRα/β בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות 'DMF-ection', פלטפורמת אלקטרופורציה דיגיטלית מיקרופלואידית (DMF). השיטה מאפשרת עריכת גנים מקבילה עם קלט נמוך עם יכולת היתכנות גבוהה, והיא גמישה עוד יותר להעברת mRNA לספירואידים תלת-ממדיים רב-תאיים.

תקציר

אלקטרופורציה מיקרופלואידית דיגיטלית (DMF) מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ובנפח נמוך של תאי יונקים, תוך מזעור קלט תאים עד פי 100 ושמירה על חיוניות. מחקר זה מציג תהליך העברה מבוסס DMF בתפוקה גבוהה עבור ניקוי CRISPR של לוקוס TRAC בתאי T תלויים ראשוניים בבני אדם ועבור העברת mRNA של ספרואידים תלת-ממדיים HEK293T. באמצעות RNA מדריך CRISPR שהופקד במרחב והרכבת ריבונוקלאופרוטאין (RNP) על הקראטידג', הושגה הפרעה יעילה של לוקוס TRAC הן באוכלוסיות תאי T של CD4⁺ והן ב-CD8⁺ תוך שימוש ב-10,000 תאים בלבד בכל מצב, כאשר היעילות לאחר העריכה עוברת את 85%. אפיון ביופיזיקלי באמצעות ניתוחי זרימה וניתוחי פיזור טיילור הראו כי תוספים פולימריים מייצבים קומפלקסים של Cas9–sgRNA בתנאי בופר אלקטרופורציה, ותומכים בעריכה שחזורית בנפחים תת-מיקרוליטריים. זרימת העבודה הותאמה עוד יותר ליישומים תלת-ממדיים על ידי העברת mRNA של EGFP לספירואידים HEK293T שלמים, מה שהוביל לפלואורסצנציה עמידה ואחידה במרחב מבלי לפגוע בצמיחת הספרואידים או במורפולוגיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי אלקטרופורציה של DMF מאפשרת עריכה יעילה של הגנום והעברת mRNA הן לתאי חיסון מועלים והן לספירואידים רב-תאיים. פלטפורמה זו מספקת פתרון בקנה מידה ובעל קלט נמוך ליישומים בטיפול בתאי CAR-T, גנומיקה פונקציונלית ומודלים תלת-ממדיים מתקדמים לתאית.

מבוא

עריכת גנים בתאי אדם ראשוניים היא מרכזית יותר ויותר הן בפיתוח טיפולי והן במחקר בסיסי, כולל יישומים בהנדסה חיסונית, מידול מחלות נדירות וגנומיקה פונקציונלית¹. למרות שאלקטרופורציה מאפשרת עריכת גנום יעילה מאוד, מערכות מבוססות קובטה קונבנציונליות דורשות בדרך כלל עד מיליוני תאים בכל מצב, מה שמגביל את השימוש בהן בדגימות שמקורן במטופלים ובאוכלוסיות חיסוניות נדירות². בנוסף, מערכות אלו אינן מתאימות במיוחד לסינון בקנה מידה גדול בשל מגבלות בתפוקה, אוטומציה וצריכת תגובות³.

אלקטרופורציה מיקרופלואידית התגלתה כגישה מבטיחה לעריכת גנום בקלט נמוך⁴. עם זאת, רוב הפלטפורמות הקיימות מסתמכות על ארכיטקטורות זרימה רציפה הכוללות טיפול מורכב בנוזלים, גמישות מוגבלת בערבוב מגבים, ודרישות תא גבוהות יחסית לכל תנאי. לעומת זאת, מיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF) מאפשרת מניפולציה פעילה של טיפות בקנה מידה ננו-ליטר בדידות על מערך אלקטרודות מישורי, ומאפשרת שליטה מדויקת על הרכב התגובה, תזמון ומיקום מרחבי. הפורמט המבוסס על טיפות מסוג plug-and-play מתאים במיוחד לתהליכי עבודה בנפח נמוך ובקצב תפוקה גבוה, שבהם שימור תאים ראשוניים ומגבים הוא חיוני⁵.

עבודות עדכניות הדגימו את ההיתכנות של משלוח תוך-תאי מבוסס DMF באמצעות ארכיטקטורות אלקטרופורציה תלת-טיפות, המייצרות שדות חשמליים מקומיים בזרם נמוך להעברת RNP ו-mRNA יעילה, תוך מזעור הלחץ התרמי והאלקטרוכימי ^6,7,8. בהתבסס על יסוד זה, פותחה פלטפורמת אלקטרופורציה מהדור הבא של DMF, בשם 'DMF-ection', הכוללת 48 אתרי תגובה ניתנים לכתובת עצמאית, תאימות מלאה לאוטומציה וייצור מחסניות בקנה מידה⁽איור 1). מחסנית ה-DMF מורכבת מפלטת PCB תחתונה ולוח עליון מפלסטיק המופרד על ידי אטם, המורכבים באמצעות סנאפים ליישור בכיוון נכון אחד (איור 1A). פריסת 48-plex מאורגנת לשמונה משפחות זהות (איור 1A–H), שכל אחת כוללת שישה אתרי אלקטרופורציה ניתנים לכתובת עצמאית, התומכת בעד 48 תנאי עריכה מקבילים לכל מחסנית (איור 1B). ספריות RNA מנחים מונחות על פני השטח של המצע באמצעות מפזר אקוסטי לפני הרכבת המחסנית. דיוק המיקום של ההפקדה אושר בכל 48 האתרים, כאשר מיקומי הטלה התקבצו בתוך סטייה תת-מילימטרית מנקודת האמצע של האלקטרודה (איור 1C), מה שתומך בהרכבת RNP אמינה על המחסנית. לאחר הטעינה, תאים וטיפות אלקטרודות נוזליות מופעלות על המחסנית ליצירת גאומטריית האלקטרופורציה התלת-טיפלית (איור 1D). לאחר האלקטרופורציה, התאים מופרקים ללוחות תרבית לצורך התאוששות וניתוח במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, ריצוף ומיקרוסקופיה (איור 1E). מערכת זו מאפשרת עריכת גנום ביעילות גבוהה תוך שימוש בעד פי 100 פחות תאים מאשר שיטות סטנדרטיות מבוססות קובטה, ומרחיבה משמעותית את הגישה להנדסת גנום ביישומים בעלי קלט נמוך ותפוקה גבוהה.

מחקר זה מעריך את ביצועי הפלטפורמה על ידי אספקת מטענים ביומולקולריים מרובים, כולל קומפלקסים של mRNA ו-CRISPR–Cas9 ריבונוקליאופרוטאין (RNP), ומשיג טרנספקציה יעילה והפרעה גנטית. בנוסף לתאי T ראשוניים, DMF-ection מספק מסגרת כללית להעברת חומצות גרעין למבנים רב-תאיים מורכבים. ספרואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ומודלים אורגנואידיים מטילים חסמים משמעותיים לחדירת תגובות בשל הארכיטקטורה והשבריריות שלהם, ושיטות אלקטרופורציה קונבנציונליות לעיתים משבשות את המורפולוגיה או יוצרות הפצה הטרוגנית. כדי להעריך האם אותם עקרונות אלקטרופורציה מוקטנים ששימשו לעריכת תאי T חלים גם על רקמות מובנות, תהליך העבודה של DMF יושם על ספרואידים HEK293T תלת-ממדיים. ניסויים אלו הראו כי אלקטרווטציה מבוססת DMF יכולה למקם בעדינות ספרואידים שלמים בתוך גאומטריות של שלוש טיפות ולתמוך בהעברת mRNA אחידה תוך שמירה על מבנה וצמיחה. למרות שתוצאות אלו אינן פרוטוקול תאי ה-T הראשוני המתואר כאן, הן ממחישות את היישום הרחב יותר של אלקטרופורציה DMF מתוכנתת למערכות תאיות תלת-ממדיות מתפתחות הרלוונטיות לגילוי תרופות ולמידול מחלות.

פרוטוקול

תאי T אנושיים ראשוניים ששימשו בפרוטוקול זה הושגו מספקים מסחריים בהסכמת תורם מדעת ובהתאם להנחיות המוסדיות, האתיות והרגולטוריות החלות. כל הטיפול בחומרים ביולוגיים שמקורם באדם בוצע בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים. חוקרים המיישמים פרוטוקול זה אחראים לוודא שהשימוש שלהם בתאים אנושיים ראשוניים עומד בדרישות ועדת ביקורת מוסדית מקומית (IRB) או ועדת אתיקה, תקנות בטיחות ביולוגית רלוונטיות, וכל חקיקה לאומית או אזורית רלוונטית המסדירה את השימוש בחומר ביולוגי אנושי. לא היה מידע מזוהה על ידי מטופל לחומר התא ששימש במחקר זה.

1. הכנה והפעלה של תאי T ראשוניים בבני אדם

1. הפשרה מהירה של תאי CD3⁺ T ראשוניים של בני אדם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים למדיום תאי T בסיסי מחומם מראש ולצנטריפוגה ב-180 × גרם למשך 10 דקות. השליך את הסופרנטנט ותלה את הכדור במצב מדיום טרי.
2. קבעו את ריכוז התאים ועמידותם באמצעות מונה תאים אוטומטי.
3. השעתי תאים ב-1 ×^{10 6} תאים/מ"ל בתווך תרבית תאי T, בתוספת נוגדן טטרמרי מסיס CD3/CD28, גירוי מפעיל תאי T (לפי הוראות הספק) ו-200 IU/mL IL-2. דגרו תאים במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   הערה: שמרו על צפיפות תאים בין 0.5–2 × 10⁶ תאים למ"ל במהלך ההפעלה. בצע הפעלה בלוחות U-bottom 96 בארות כדי למקסם את המגע בין התא למפעיל ויעילות ההפעלה.

2. הכנת כתמי RNA מונחים על מצע ה-DMF (כתמים אקוסטיים במפזר)

1. שחזור sgRNA ליופילי במים נטולי נוקלאז לריכוז מלאי של 100 מיקרומון. בצינור נפרד, יש להכין מלאי של 100 מ"ג/מ"ל של חומצה פולי-L-גלוטמית (PGA, מלח נתרן, MW 15,000–50,000 Da) במים נטולי נוקלאז. משלבים את מאגר sgRNA ו-PGA ביחס נפח של 5:4 (sgRNA: PGA) שמניב ריכוז סופי של sgRNA של 55.6 pmol/μL וריכוז סופי של 44.4 mg/mL במים נטולי נוקליאז. מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 30 שניות, ומפרקים לנפחים חד-פעמיים ומאחסנים אליקווטים לא בשימוש בטמפרטורה של −80°C עד 6 חודשים.
   הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
2. הוסיפו את תערובת המדריך-PGA לפלטת מקור אקוסטית בנפח מת נמוך בבארות התואמות לפריסת אתר התגובה הרצויה.
3. העבר 40 ננו-ליטר (שווה ערך ל-2.2 pmol sgRNA) מתערובת ה-guide-PGA לכל אזור סימון יעד במצע ה-DMF באמצעות מפזר אקוסטי מכויל.
   הערה: ב-55.6 pmol/μL, 40 nL מספק 2.2 pmol sgRNA לאתר (55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). מדרכים מיובשים מורכבים מחדש במהלך מיזוג טיפות על המחסנית; השעיה מלאה מאושרת על ידי יעילות עריכה עקבית בין האתרים.
4. בארון בטיחות ביולוגית, אפשר לטיפות המנוקדות להתייבש באוויר לחלוטין בטמפרטורת החדר עד שלא יישאר נוזל נראה לעין (כ-5 דקות).
   הערה: אין להשתמש בזרימת אוויר מאולצת או חום, שכן זה עלול להזיז או לפגוע ב-RNA המנחה.
5. הרכיבו את מחסנית ה-DMF.
   1. בארון בטיחות ביולוגי, יישר את הלוח העליון מעל המצע המנוקד על ידי התאמת תכונות הפיצוץ הפלסטיות הא-סימטריות מהפלטה העליונה עם החריצים בלוח התחתון. הפעילו לחץ אחיד וסימולטני לאורך הקצוות הקצרים עד שמרגישים נקישה מכנית ברורה, המאשרת את החיבור המלא של תכונות הנעילה.
      הערה: המחסנית מעוצבת עם כיוון נכון אחד; הרכבה לא נכונה לא תגרום ל-snap. החזק את המצע בקצוות כל הזמן כדי למנוע זיהום או נזק למשטחים פונקציונליים ולהימנע מההחלקה של המצעיים זה על זה, שכן זה עלול לשרוט את ציפויי המשטח.
   2. נקודת ביקורת: אשר את ההרכבה הנכונה על ידי ה-snap המכני.
      הערה: אין אינדיקטור חשמלי מוקדם לשלמות הציפוי; כל כשל פונקציונלי הנובע מהרכבה לא נכונה מזוהה אוטומטית ומדווח בדוח בקרת איכות לאחר ההרצה.
      נקודת עצירה: אחסן מחסניות מורכבות שלא נעשה בשימוש באריזה אטומה עם חומר ייבוש (שקיות סיליקה ג'ל) בטמפרטורת החדר למשך עד 48 שעות.

3. הכנת תאים

1. הכינו 1 מ"ל של בופר טרנספקציה מלא טרי לפני כל שימוש על ידי שילוב בופר אלקטרופורציה תואם DMF עם סורפקטנט ביוקומוניטיבי לא-יוני ביחס 20:1 (v/v) (בופר אלקטרופורציה: סורפקטננט), מה שמניב ריכוז סופי של 0.05% (v/v). ערבבו בעדינות ותשאירו על הקרח.
   הערה: בופר הטרנספקציה התואם ל-DMF המשמש כאן הוא בופר איזוטוני בעל מוליכות נמוכה (מוליכות: 3.5 mS/cm, אוסמולליות: 305 mOsm/L). חוקרים המשתמשים במאגרים חלופיים צריכים לאמת תאימות להפעלת DMF ולחיוניות התאים. הסורפקטנט הביוקומוניטיבי הלא-יוני משמש להפחתת הצמדת הטיפות; אם לא נעשה שימוש בחומר השטח המסופק, יש תחליף מתאים.
2. שטוף תאי T מופעלים פעם אחת עם בופר טרנספקציה (שאינו מכיל חומר פעיל). צנטריפוגה בעוצמה של 180 × גרם למשך 5 דקות, שאיפת הסופרנאנט, והשיה מחדש את כדור התא בבופר טרנספקציה מלא (המכיל חומר פעיל) ב-1.0 × 10⁷ תאים/מ"ל בנפח כולל של 100 מיקרוליטר לכל מחסנית. תשמור על הקרח.
3. מיד לפני הטעינה על המחסנית, הוסף נוקלאז Cas9 ישירות ל-100 מיקרולטר של מתלה T ומערבב על ידי פיפטינג עדין; תשמור על הקרח.
   הערה: עבור תאי T ראשוניים, Cas9 נטען ב-42 pmol לכל נפח מחסנית של 100 מיקרוליטר (0.42 pmol/μL). כל אתר אלקטרופורציה מעבד כ-1 מיקרוליטר של תליית תא, ומספק 0.42 pmol Cas9 לכל עריכה. אופטימיזציה של מינון זה בעת הסתגלות לסוגי תאי חיסון אחרים (ראו טבלה 1).

רכיב	ריכוז סופי לפי עריכה
Cas9	0.42 pmol בטיפת ~1 מיקרוליטר
sgRNA	2.1 pmol (ממקום 40 ננו-ליטר)
PGA	מלאי 44.4 מ"ג/מ"ל בתערובת ספוטינג
סרפקטנט	0.05% (v/v)
קלט תא	~10,000 תאים

טבלה 1: טבלת סיכום הריכוזים הסופיים בכל טיפה טרנספקציה.

4. טרנספקציה על פלטפורמת DMF-ection

1. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מזרים 10 מיקרוליטר מתערובת T-cell/Cas9 לכל אחד מ-8 פתחי הטעינה של התאים, ו-10 מיקרוליטר של בופר טרנספקציה מלא ל-16 פתחי טעינת האלקטרודות הנוזליות (כפי שמוצג באיור 1).
2. הגדר את המתח ל-500 וולט, משך הפולס ל-3 מילישניות, ומספר הפולסים ל-2. התחל את רצף האלקטרופורציה לפי הוראות הפלטפורמה.
   1. נקודת צ'קפוינט: עברו על דוח ה-QC לאחר הריצה מיד לאחר הריצה. כשלים ספורדיים (<10% מהאתרים) אינם דורשים התערבות. אם התקלות שיטתיות, החלף את הקלטת בלוח האיכות, הרץ את בדיקת בריאות המערכת (~2 דקות), ופנה לתמיכה הטכנית אם הבעיות נמשכות.

5. פריקה ושחזור של תאי T ערוכים

1. באמצעות מטפל נוזלי, העבירו תאים אלקטרופורטיביים מכל אתר תגובה ללוח U תחתית עם 96 בארים המכיל 150 מיקרוליטר של מדיום תאי T בסיסי מחומם מראש בתוספת 200 IU/mL IL-2.
2. דגרו תאים למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO₂ כדי לאפשר מחזור חלבונים ושינויים בביטוי הקולטנים על פני השטח.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של TRAC knockout

1. העבר תאים לפלטת תחתית חרוטית סטרילית עם 96 בארים כדי להפחית אובדן תאים בין שטיפות. שטפו תאים פעמיים עם בופר זרימה ציטומטרי (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות והסרת הסופרנטנט על ידי הפיכת הפלטה התחתונה הקונית. התאים יישארו גלויים בצלחת.
2. הכינו תערובת מאסטר לצביעת שטח הכוללת נוגדנים אנטי-CD4, אנטי-CD8 ואנטי-TCRα/β ב-Flow Cytometric Buffer בריכוזים מומלצים על ידי היצרן. הוסף 25 מיקרולטר מהתערובת הראשית לכל באר ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגן מאור. שטוף פעמיים עם 1× PBS (בלי FBS) על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות. החזירו תאים ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS המכילים צבע חיוני ב-1:1,000 (v/v) ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.
   הערה: לוחות תחתית חרוטיים יעילים ביצירת תאים; בדוק שהתאים תלויים היטב בכל שלבים.
3. שוטפים תאים פעמיים עם בופר זרימה-ציטומטריה והשלים מחדש 150–200 מיקרוליטר לכל דגימה לצורך רכישה.
4. הגדר את הציטומטר עם קווי לייזר ומערכות סינון מתאימים לפלואורוכרומים (למשל, עירור 488 ננומטר לצבע חיוניות; 405 ננומטר או 488 ננומטר לסימני משטח לפי הצורך). קבע מתחים באמצעות בקרות פיצוי צביעה בודדת ודגימה לא מוכתמת. אסוף מינימום 5,000 אירועי סינגל חיים לכל דגימה. השער ברצף מופעל: סינגלטים פיזוריים → תאים חיים (שלילי לצביעה חיונית) → CD4⁺ או CD8⁺ → ביטוי TCRα/β.
   הערה: בתנאים סטנדרטיים, סך כל האירועים החיים שנרכשו יכול לנוע בין 5,000 ליותר מ-10,000 לכל דגימה לאחר אובדן במהלך שטיפה וצביעה, בהתחשב בכך שהתאים הספיקו להתרבות.
5. קבעו את ההפרעה בגנים של TRAC על ידי מדידת תדירות התאים השליליים TCRα/β באוכלוסיות CD4⁺ ו-CD8⁺. דווח על יעילות הנוקאאוט כאחוז התאים השליליים TCRα/β ביחס לשער הסינגלט החי עבור כל תת-קבוצה.

תוצאות

תוצאות צפויות
אלקטרופורציה של 10,000 תאי T מופעלים בכל מצב בדרך כלל מביאה ליעילות של >85% TRAC עם חיוניות >95% 72 שעות לאחר הטרנספקציה. ציטומטריית זרימה מגלה אובדן ברור של צביעת TCRα/β במצב המיקוד ב-TRAC ביחס לבקרות sgRNA (NTC) שאינן נחשפות לשדות חשמליים. אלא אם צוין אחרת, n מייצג ריצות DMF-ection עצמאיות שבוצעו בימים נפרדים. שכפולים טכניים מאותו ריצת מחסנית נמדדו בממוצע לפני ניתוח סטטיסטי ואינם תורמים באופן עצמאי ל-n. כל הניסויים בתאי T שדווחו כאן נערכו באמצ...

דיון

פרוטוקול זה מתאר תהליך אלקטרופורציה מיקרופלואידי דיגיטלי מוקטן שמאפשר העברה תוך-תאית יעילה לתאי T ראשוניים של בני אדם באמצעות טיפות בקנה מידה ננו-ליטר. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא היכולת לבצע עריכת גנום ב-CRISPR–Cas9 באמצעות 10,000 תאים בלבד בכל תגובה, מה שמפחית משמעותית את דרישות החומר בהשוואה לאלקטרופורציה קונבנציונלית. הארכיטקטורה המבוססת על טיפות תומכת באוטומציה, ומבטיחה טיפול משוחזר במגבים והרכבת תגובה באתרים מקבילים מרובים.

במחקרים קודמים, השוואה ישירה של...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol