אלגוריתם ניתוח צורה מכמת את המורפולוגיה המרחבית וההקשר של תרבית תאים דו-ממדית לתלת-ממדית לצורך כימות חדש של פנוטיפים

סיכום

מאמר זה מסביר כיצד ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות חדשות בתאים ואורגנואידים באמצעות טרנספורמציית הקואורדינטות הקוטבריות הדחוסות (LCPC), אלגוריתם מרחבי שאוסף תכונות שמדדים מסורתיים כמו שטח, נפח ושטח פנים אינם יכולים. נדונות שיטות עבודה מומלצות לכיוון צורה ויישור הצורה.

תקציר

מחקרים רבים הראו כי הפנוטיפ המורפולוגי של תא או אורגנואיד קשור לרגישותו לסוכנים אנטי-סרטניים. עם זאת, שיטות מסורתיות למדידת פנוטיפ מסתמכות על מדדים מרחביים כמו שטח, נפח, היקף ועוצמת אות, שפועלים אך מוגבלים. גישות אלו אינן יכולות למדוד תכונות קריטיות רבות של הקשר מרחבי, כגון כיראליות, תכונה של יד שמאל וימין. לא ניתן להשתמש בנפח כדי לרשום כיראליות כי לנעליים השמאלית והימנית יש את אותו עוצמה. למרות שההקשר המרחבי בצורת ציר הכירליות, כיוון הכבידה והקוטביות הוא אינטואיטיבי לבני אדם, המדדים המסורתיים בהם השתמשו ביולוגים תאיים, פתולוגים, רדיולוגים ואנשי למידת מכונה עד כה אינם יכולים ללכוד את הרעיונות הבסיסיים הללו. המרת הקואורדינטות הפולריות הדחוסות (LCPC) היא אלגוריתם חדשני שיכול ללכוד הקשר מרחבי שאין כמותו של מדד אחר. טרנספורמציית LCPC מתרגמת קווי מתאר דו-ממדיים (דו-ממדיים) לגל סינוסואידלי בדיד על ידי הצבת מערכת רשת שעוקבת אחרי נקודות החיתוך בין קווי המתאר לקווי הרשת. הוא הופך את הקונטור לרצף של זוגות של קואורדינטות בדידות, כאשר הקואורדינטה הבלתי תלויה (קואורדינטת x) מתאימה למיקומים עוקבים במרחב דו-ממדי. כל קואורדינטה תלויה (קואורדינטת y) מורכבת מהמרחק בין חיתוך קווי המתאר וקו הרשת למקור או קו הבסיס של מערכת הרשת. בצורת גל סינוסואידי בדיד, הטרנספורמציה פורייה המהירה מוחלת על הנתונים. בדרך זו, צורות התאים בתרבות תאים דו-ממדית ותלת-ממדית מיוצגות באופן שיטתי ורב-ממדי, מה שמאפשר סטרטיפיקציה כמותית חזקה שתחשוף תובנות לגבי עמידות לטיפול.

מבוא

תרבית אורגנואידים תלת-ממדית (3D) הוכיחה את עצמה כעדיפה על תרבית תאים דו-ממדית (2D) במחקות ביולוגיה בחיים ^1,2. אורגנואידים הפכו לבלתי נפרדים במחקר סרטן לסינון טיפולים יעילים ולהשגת תובנות על התקדמות המחלה 3,4,5,6. בעוד שידוע בביולוגיה של סרטן שהבדלים במורפולוגיה קשורים להתנהגות ביולוגית מובחנת של תאים ורקמות, התחום נשען על מדדי צורה מסורתיים שמוגבלים בהיקפו. מחקר זה מתאר אלגוריתם מרחבי חדשני שמכמת באופן אובייקטיבי תכונות מורפולוגיות עדינות בדיוק חסר תקדים, ועולה על גישות מסורתיות כמו שטח, נפח ושטח משטח.

הטרנספורמציה הקואורדינטית הפולרית הדחוסת (LCPC) הומצאה כדי לתאר באופן אובייקטיבי וכמותי מורפולוגיות מורכבות הנצפות בהיסטופותולוגיה של רקמות, במטרה לשפר את דירוג^פוליפי המעי הגס. הרצון להרחיב את הגישה הזו כדי ללכוד תכונות מרחביות מבוססות MRI מקרוסקופיות בפתולוגיות מוח, כגון הפרעה דו-קוטבית ומחלת אלצהיימר, הוביל להרחבות שהעמיקו אותה אף יותר. מחקר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב ואת שיטות העבודה המומלצות ליישום שתי גרסאות של טרנספורמציית LCPC: מערכת הרשת המקבילה ומערכת הרשת הרדיאלית, שלתיהן יש סקריפטים בקוד פתוח וסרטוני הדרכה.

מלבד שיטות גיאומטריות מסורתיות, קיימות הפשטות רבות שהיו יעילות למדידת צורות מורכבות של תאים ואיברים. אלה כוללים מדידת אקסצנטריות, סטייה, ניגודיות וקורטוזיס, יחד עם רגעי זרניקה ללכידת מעגליות, אסימטריה, אי-סדירות קצוות ומבנה קווי מתאר גלובלי ^8,9,10. ניתוח פרקטלי היה גם שימושי לצמצום קווי המתאר המרוכבים לערכים סקלריים, כמו ממד פרקטלי, שמודד עד כמה הקוטור לא סדיר, ולקונריות, שמודדת כיצד פערים לא סדירים נראים בהטרוגניות בקונטור^11,12. למדידת מרקם, שיטת מטריצת ההופעה המשולבת ברמה אפורה (GLCM) פופולרית למדידת ניגודיות, אנרגיה, הומוגניות, קורלציה ואנטרופיה^13,14. למרות שכל השיטות הללו מועילות, אף אחת מהן לא נועדה ללכוד הקשר מרחבי, כמו כיוון הכבידה, יד שמאל מול ימין, או מיקום מבנה התמיכה המרכזי שמשפיע על כיוון שינוי הצורה. יתרה מזאת, רבים מהם מייצרים ערך סקלרי יחיד או רק קומץ ערכים סקלריים לייצוג מידע מרחבי, ולכן המחקרים המצוטטים משתמשים בהם לעיתים קרובות בשילוב כדי להעריך צורות מורכבות.

טרנספורמציית LCPC תוכננה לייצר תכונות רבות ממדידה אחת ולאפשר הוספת סימנים מרחביים שמקודדים הקשר מרחבי לצורה, כמו כיוון הכבידה. השיטה הקרובה ביותר לטרנספורמציית LCPC⁷ פורסמה שנה לאחר¹⁵, וחולקת את אותו רעיון מרכזי כנקודת התחלה: יישום טרנספורם פורייה על קווי המתאר של התאים כדי למדוד צורה בצורת ספקטרום תדרים. עם זאת, טרנספורמציית ה-LCPC פותחה באופן עצמאי לשימוש באמצעות מערכות רשת נפרדות שנועדו לשמש יחד עם ידע על ההקשר המרחבי מחוץ לצורה הנמדדת. יתרה מזאת, ממציא טרנספורמציית LCPC מסביר בכתב יד זה כי ספקטרום התדרים המתקבל מכיל כמויות עצומות של מידע מרחבי נסתר. קובץ משלים 1 מכיל דיון נרחב בהקשרים מרחביים בביולוגיה שלרוב מתעלמים מהם כאשר משתמשים בשיטות המצוטטים, וכיצד ניתן ליישם את טרנספורמציית LCPC כדי ללכוד הקשר זה. לקוראים שנתוני הצורה שלהם לא מראים הבדל בין קבוצות ביקורת לקבוצות ניסוי, בין אם העיניים שלהם רואות הבדל בצורות, או שנתוני הצורה שלהם מראים הבדל קטן מאוד, למרות שהם חושדים שצריך להיות הבדל גדול יותר, כדאי לנסות את טרנספורמציית LCPC.

טרנספורמציית LCPC מספקת רמת דיוק חסרת תקדים במדידת מידע מרחבי, משום שהיא מייצגת צורות בממדים מרובים. בניגוד לשיטות מסורתיות, כמו שטח ונפח, שמניבות רק ערך סקלרי אחד לכל צורה (כלומר, 25^{ס"מ רבוע}), תוצאות טרנספורמציית LCPC יכולות להניב מספר אינדקסים, שכל אחד מהם מתאם להיבט מורפולוגי שונה של הצורה (כלומר, עיגול לעומת חדות פינות, חלקות לעומת משוננות של הקצוות). טרנספורמציית LCPC מתארת צורה דו-ממדית על ידי שכבת רשת של קווים ישרים החוצים את קווי המתאר שלה. לכל מערכת רשת יש מוצא (איור 1) או קו בסיס (איור 2) ממנו ניתן למדוד מרחק ליניארי. עיין באיורים 1B ו-2B לתרשימי זרימה פשוטים המתארים את האלגוריתם. כל נקודת חיתוך בין קווי הרשת לקווי המתאר של הצורה מזוהה. המרחק של כל חיתוך מחושב ביחס לקו הבסיס או למקור. בדרך זו, טרנספורמציית LCPC ממירה צורות דו-ממדיות לסדרה של זוגות קואורדינטות x-y עוקבים. קואורדינטת ה-x מייצגת את מיקום קו הרשת מאפס לאינסוף, בעוד קואורדינטת ה-y מייצגת את המרחק בין החיתוך לקו הבסיס או המוצא. בצורה זו, שהיא גל סינוסואידי בדיד, מוחל טרנספורם פורייה מהיר (FFT) להמרת הנתונים מ"תחום המיקום" לתחום התדר. אם קואורדינטת ה-x מייצגת זמן, אז "תחום המיקום" יהיה שקול ל"תחום הזמן" ביישומים הסטנדרטיים של FFT.

בעוד שמערכת הרשת הרדיאלית מודדת את המרחק של כל חיתוך ממוצא הרשת הרדיאלית (איור 1A), מערכת הרשת המקבילה תמיד מודדת את מרחק החיתוכים בהתייחסות לקו דמיוני משמאל לצורה (איור 2A). הסקריפט בקוד פתוח קובע את מיקום הקו המדומה הזה על ידי מציאת הפיקסל השמאלי ביותר של הקונטור ואז הזזת 10 פיקסלים שמאלה למיקום זה. כאן, קואורדינטת ה-x של מיקום זה הופכת לקו הייחוס שממנו מחושבים כל החיתוכים. כלל 10 הפיקסלים הזה הוא שרירותי, אך זו הסיבה שכל קווי המתאר שמנותחים על ידי סקריפט הקוד הפתוח למערכת הרשת המקבילה חייבים להכיל לפחות 15 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים.

בצורות דו-ממדיות עם קפלים או שכבות מרובות, קווי רשת עשויים לחצות את הקונטור יותר מפעם אחת. במקרה זה, מרחקי כל החיתוכים לאורך קו רשת מסוכמים לערך אחד. לכן, לכל קו רשת יש רק קואורדינטת x אחת וקואורדינטת y אחת. סכום זה מיוצג על ידי המונח "דחוס" בשם טרנספורמציית LCPC. העיבוד של צורה דו-ממדית לא ליניארית לגל סינוסואידי בדיד מיוצג על ידי המונח "ליניארי" בשם האלגוריתם. לבסוף, המונח "קואורדינטות פולריות" מופיע בשם האלגוריתם, משום שמערכת הרשת הראשונה שנוצרה הייתה רשת רדיאלית של 180 מעלות של קואורדינטות קוטביות⁷. גם לאחר שהבינו שהקואורדינטות הקוטביות והקרטזיות ניתנות להחלפה, שם האלגוריתם נשמר כפי שהוא. סעיף התודה מתאר את הסיבות האישיות שהניעו את ההמצאה וההרחבה של טרנספורמציית LCPC.

פרוטוקול 1 היה הרצף לקבלת הנתונים המוצגים באיור 3B, בעוד שפרוטוקול 2 היה הרצף לקבלת הנתונים המוצגים באיור 3C–D. השלבים בפרוטוקולים אלו מיושמים בסקריפטי פייתון נפרדים הזמינים במאגר GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. פרוטוקול 1 הוא דוגמה לשלבי קדם-עיבוד ליצירת "צורה טהורה" כהכנה לטרנספורמציית LCPC. פרוטוקול 2 הוא דוגמה לשלבי קדם-עיבוד למדידת צורות "בקנה מידה", כלומר בקנה המידה המקוריים שלהן יחסית זה לזה.

ניתן לבצע סגמנטציה ידנית בתוכנות עיבוד תמונה, כמו Preview של Mac או Paint של מיקרוסופט, או באמצעות שיטות מבוססות סף. אם עושים זאת ידנית, יש לבחור אחד מארבעת הצבעים הבאים: כחול, ירוק, ורוד/מג'נטה או אדום. מאגר GitHub שנקרא "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ מכיל תיקייה בשם "סקריפטים של חילוץ צבע". תיקייה זו מכילה ארבעה קבצי Jupyter Notebook עם קוד פייתון שמחלצים את ארבעת הצבעים שהוזכרו קודם וממירים אותם למסכות כחולות על רקע לבן. תהליך זה יכול להתבצע גם על ידי סף צבע המתאר בתוכנת עיבוד תמונה כמו Fiji/ImageJ. לתמונות שמכילות קווי מתאר עם גבולות נוגעים או קצוות חופפים (למשל, דיאגרמת ון), יש להפריד אותן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה, כך שיהפכו לאובייקטים עצמאיים בתמונת המסכה המורכבת המכילה קווי מתאר אורגנואידים מרובים. זה לא חל על תמונות שמכילות רק אורגנואיד אחד או על מספר אורגנואידים שאינם נוגעים זה בזה.

פרוטוקול

התאים האנושיים הראשוניים ששימשו במחקר זה הושגו וגודלו תחת אישורי אתיקה ונהלי הסכמה מדעת שדווחו^{קודם לכן 17}. התמונות המוצגות כאן נוצרו מתרביות תאים מאושרות ופורסמו לראשונה. דגימות רקמה נאספו בבית החולים בריגהם וומן ובאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו לפי פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) ממטופלים שנתנו הסכמה מדעת לשימוש מחקרי ברקמות שלהם, כפי שתואר קודם¹⁷. לא בוצע איסוף דגימות אנושיות נוספות למחקר זה.

1. חילוץ הצורה הטהורה של קווי המתאר האורגניים הדו-ממדיים עבור טרנספורמציית LCPC

1. חלקו את הקצה החיצוני של כל אורגנואיד באמצעות כל תוכנת עיבוד תמונה, כמו Paint של מיקרוסופט, Preview של MacOS, או Fiji/ImageJ.
2. הוציא את קווי המתאר של האורגנואידים כמסכות פתוחות בצורת קווים כחולים על רקע לבן.
3. בודדו כל קווי מתאר כחולים על קנבס לבן משלו.
   הערה: שלב זה נחוץ רק אם תמונה מכילה יותר מקוטור אחד.
4. חתוך כל קווי מתאר כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת צידי האובייקט הכחול.
5. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים.
6. סובב את העצמים כך שהאורך הפנימי הארוך ביותר יהיה אופקי.
   הערה: שלב זה הופך את הקו הפנימי הארוך ביותר בתוך כל אובייקט לרוחב האובייקט. ישנם שני תסריטים זמינים למטרה זו. לצורות סגורות, השתמש במחברת Jupyter בשם "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". לצורות פתוחות או צורות עם מספר רכיבים, השתמש במחברת Jupyter בשם "Rotate Green Line_v3.ipynb". לכלי Rotate Green Line יש מדריך וידאו שמקושר בקובץ ReadMe שנמצא באותה תיקייה כמו קובץ .ipynb.
7. חתוך כל תמונה כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת הצדדים של האובייקט הכחול.
   הערה: זה זהה לשלב 1.4. המטרה של החיתוך הפעם, עם זאת, היא שהשלב הבא בשינוי גודל יקנה את גודל כל הקנבס, לא רק את האובייקט הכחול שבו. לכן, על ידי הפיכת האובייקט הכחול כמעט לאותו רוחב וגובה כמו הקנבס עצמו, שינוי גודל הקנבס לרוחב 400 פיקסלים גם משנה את גודל האובייקט לכמעט 400 פיקסלים. יש מחברת Jupyter בשם "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. שנו את רוחב הקנבס של כל תמונה ל-400 פיקסלים, תוך הגבלת יחס הגובה-רוחב.
   הערה: שלב זה גורם לכל אובייקט להיות באותו רוחב. הגבלת יחס הגובה-רוחב מונעת עיוות של האובייקט במהלך שינוי הגודל. קיים Jupyter Notebook בשם "Resize width to 400 pixels but constrain ratio.ipynb".
9. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים.
10. סובבו כל תמונה ב-90 מעלות בכיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להפוך את האורך הפנימי הארוך ביותר לאנכי, בהתאם לבחירה בכל התמונות.
    הערה: ברצף הנ"ל, צורה טהורה מתקבלת על ידי יישום רציף של שלבים 1.6, 1.7, 1.8 ו-1.9. הוספת מרווח מרווחים בשלב 1.9 נדרשת כדי למנוע שגיאות בסקריפטי הטרנספורמציה של LCPC שיבוצעו בהמשך, אך אינה מעורבת בהפקת הצורה הטהורה. משתמשים המעוניינים למדוד צורות "בקנה מידה בקנה מידה" אינם חייבים לבצע את שלבים 1.6, 1.7 ו-1.8 ברצף הנ"ל, אך עדיין עליהם לעבד מראש את תמונות המסכה כדי להגיע לכיוון אופטימלי לפני יישום טרנספורמציית LCPC.
11. בצע את טרנספורמציית LCPC על כל קו מתאר. השתמש בסקריפטים של פייתון שסופקו עבור שיטת הרשת הרדיאלית¹⁸ או שיטת הרשת המקבילה¹⁹.

2. הפקת צורה בקנה מידה של קווי מתאר אורגנואידים דו-ממדיים עבור טרנספורמציית LCPC

הערה: שיטת שלב אחר שלב לחילוץ הצורה בקנה מידה של אובייקטים דומה לזו של חילוץ צורה טהורה בפרוטוקול 1 לעיל. השלבים נקראים זהים בשני הפרוטוקולים לנוחות ההתאמה. אנא עיין בהערות בפרוטוקול 1 עבור כל שלב. ההבדל העיקרי בין צורה טהורה לצורה בקנה מידה הוא שצורה בקנה מידה לא דורשת שלבים 1.6, 1.7 ו-1.8, שהם שלבי שינוי הגודל.

1. חלקו את הקצה החיצוני של כל אורגנואיד. השתמש בגישה חישובית או עשה זאת ידנית באמצעות תוכנת עריכת תמונות בסיסית, כמו Paint של מיקרוסופט, Preview של MacOS, או Fiji/ImageJ.
2. הוציא את קווי המתאר של האורגנואידים כמסכות פתוחות שהם קווים כחולים על בד לבן. השתמש ב-Fiji/ImageJ לחילוץ מסכות או בסקריפט פייתון^{שסופק 16}.
3. בודדו כל קווי מתאר כחולים על קנבס לבן משלו. השתמש ב-Fiji/ImageJ לחילוץ מסכות או בסקריפט פייתון^{שסופק 16}.
4. חתוך כל קווי מתאר כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת צידי האובייקט הכחול. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
5. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
6. סובב כל קווי מתאר כך שהקו הפנימי הארוך ביותר שלו יהיה אנכי. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
7. בצע את טרנספורמציית LCPC על כל קו מתאר. השתמש בסקריפטים של פייתון שסופקו עבור שיטת הרשת הרדיאלית¹⁸ או שיטת הרשת המקבילה¹⁹.

תוצאות

טרנספורמציית הרשת הרדיאלית LCPC המיושמת על אורגנואידים של סרטן השד

אורגנואידים תלת-ממדיים וגידולים יכולים לאמץ מגוון צורות, שחלקן שונות באופן ברור מהעין האנושית, אף על פי שמדדים מסורתיים מציבים הבדלים סטטיסטיים זئيרים. מצד שני, אורגנואידים יכולים גם להציג צורות שנראות הטרוגניות, ולכן לא משמעותיות, לעין האנושית, ומסתירות מורפולוגיות עדינות שמופיעות שוב ושוב המייצגות תת-סוגים מובחנים. אורגנואידים ראשוניים של שד אנושיים הופקו ממטופלות וגודלו בתלת...

דיון

כמו בכל כלי חישוב, איכות הפלט תלויה בשאלה האם הקלטים עומדים בכללים הצפויים שסביבם הכלי תוכנן. יש לעקוב אחרי הכללים הבאים ולהשתמש בהם כבדיקות בקרת איכות בעת שימוש בסקריפטי פייתון שסופקו. ראשית, ודא שהמסכות הפתוחות הן קווים כחולים על רקע לבן. כחול היה החלטה שרירותית ואין לה משמעות, אך הסקריפטים שמבצעים את טרנספורמציית LCPC נכתבו כדי לחפש פיקסלים כחולים על רקע לבן. שנית, אל תריץ את סקריפטי הטרנספורמציה של LCPC על תמונות שיש להן פחות מ-10 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים. ראו את הסרטון ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook