מאמר שיטה

אימונולוקליזציה תלת-ממדית במיוציטים של תירס

DOI:

10.3791/71224

⸱

22 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 2Lankester Botanical Gardens, University of Costa Rica, 3Faculty of Food and Agricultural Sciences, Rodrigo Facio Campus, School of Agronomy, University of Costa Rica, 4Fabio Baudrit Agricultural Research Station, University of Costa Rica

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול האימונולוקליזציה הזה במיוציטים זכריים של תירס שומר על שלמות תלת-ממדית של התאים במהלך המיוזה. הוא מאפשר מעקב דינמי אחר המיקום התוך-תאי של עד שלושה נוגדנים עצמאיים בחומר משומר עם פאראפורמלדהיד, בנוסף ל-DAPI, שמצבע DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך פרופאזה מיוטית I, הקונפיגורציה הפיזית של הכרומוזומים משתנה מאוד בין שלבי ההתפתחות, ולמזלנו, תצורות ספציפיות אלו מאפשרות זיהוי נכון של כל אחד מהשלבים המיוטיים הקלאסיים הללו, הידועים בהתאמה כלפטוטן (למשל 'חוטים דקים'), זיגוטן (למשל 'חוטים מחוברים'), פאכיטן (למשל 'חוטים עבים'), דיפלוטן (למשל 'החוטים הכפולים') ודיאקינזיס (למשל 'תנועת הדחייה'). ניתוח חזותי של מספר תופעות ציטוגנטיות המתרחשות במהלך פרופאזה I, כגון רקומבינציה, זיווג וסינפסיס, דורש טכניקות אימונולוקליזציה אמינות מאוד. בניגוד לטכניקות ההתפשטות והדחיסה המסורתיות שמדכאות כל מידע תת-תאי ותת-גרעיני, הליך השימור התלת-ממדי המתואר כאן מאפשר שימור חלבונים מיוטיים מרכזיים באתרי התת-תאים הטבעיים שלהם (ציטופלזמה, גרעינית ותת-גרעינית: אאוכרומטין, הטרוכרומטין ונוקלאולר). לכן, פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבע ביעילות אנתרים מיוטיים, לנתח ולשחרר מיוציטים מאנתרות, ולבצע אימולוקליזציה סימולטנית של שלושה חלבונים מרכזיים במיוציטים זכריים בתירס.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיוזה היא תהליך מרכזי המווסת את העברת התכונות בצמחים ובגידולים מודליים; לכן, שיטות מיקרוסקופיה פשוטות שמאפשרות הדמיה עקבית ונאמנה של מיקום החלבונים מקלות על הבנת האופן שבו תכונות אלו יכולות להיות מועברות ביעילות רבה יותר. למרבה הצער, ההדמיה של מיקום החלבונים בתוך מיוציטים השתנתה מאוד בהתאם לטכניקה שבה נעשה שימוש 1,2. לכן, מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה פשוטה וניתנת לשחזור שמבטלת ארטיפקטים במהלך התצפית על מיוציטים. לדוגמה, מוכר זה זמן רב כי תצפית על כרומוזומים מיוטיים היא תהליך עדין שמתבצע על ידי ריסוק התאים באמצעות דחיסה פשוטה או טכניקות התפשטות מפריעות אף יותר. ב-Arabidopsis thaliana, חוקרים משתמשים לעיתים קרובות בשיטות הפצה המשתמשות בתערובת של קרנוי (תערובת 3:1 של אתנול וחומצה אצטית) יחד עם חומרי ניקוי שונים כמו ליפסול, טווין-20 וטריטון X-100, וכן תערובות אנזימים המכילות צלולאז, פקטינאז וציטוהליקאזים, כדי לפרק תאים ולאפשר אימונולוקליזציה יעילה על הכרומוזומים הקטנים 1,2. טכניקות אלו משנות קונפורמציה של כרומוזום תלת-ממדי לדו-ממדית, ומאפשרות תצפית מהירה על כל הכרומוזומים המפוזרים מלאכותית בתמונה אחת. תכונות מסוימות של כרומוזומים העוברים טיפולים קשים אלו עשויות להיות ברורות; עם זאת, לעיתים קרובות הם אינם מייצגים את ההתנהגות הטיפוסית של תאים וכרומוזומים ב-vivo6. זיהוי מהיר ורחב מאוד של עד שני נוגדנים אפשרי באמצעות טכניקות הפצה דו-ממדיות במגוון מיני צמחים, כולל תירס 7,8,9,10,11.

עם זאת, למרות הנוחות של טכניקות דו-ממדיות ישנות, כיום מוכר שתופעות מסוימות רגישות לשיטות מפריעות ולא ניתן לראות אותן אם התא, הגרעין או הכרומוזומים ניזוקים במהלך התפשטות או דחיסה. לדוגמה, תנועת חלבון RAD50 מהציטופלזמה לגרעין במהלך שלב הלפטוטן, או במהלך קישור צנטרומר (לפטונמה/זיגונמה), זוהתה רק במיוציטים תלת-ממדייםשלמים 12. כאן מוצע לקוראים פרוטוקול תלת-ממדי מפורט בן 4 ימים המשתמש באנתרים מקובעים ב-4% פאראפורמלדהיד כדי לאימונולוקליזציה של שלושה חלבונים מרכזיים במיוציטים זכריים של תירס, ובכך לשמור על שלמותם המבנית. בהשוואה למתודולוגיית אימונולוקליזציה תלת-ממדית של תירסדומה 8, הוספנו הערות מעשיות וטיפים לפתרון תקלות לחוקרים. פרוטוקול זה יועיל לעבודתם של ביולוגים של צמחים ומגדלי צמחים המעוניינים לחקור תהליכים מיוטיים שונים, כגון שליטה ברקומבינציה המיוטית על ידי הקומפלקס הסינפטונמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהירות: לטפל בפורמלדהיד ואקרילאמיד באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ומכסה כימיקלים; שניהם רעילים (אקרילאמיד גם נוירוטוקסי לפני הפולימריזציה). כל החומרים בהם השתמשו במחקר מופיעים בטבלת החומרים.

1. קיבוע אנתרים של תירס לשימור המבנה השלם של מיוציטים

  1. השתמש בצמחי תירס בשלב V13 עם תפרחות שעדיין גדלות בתוך הגבעול. במהלך שבוע של קיבוע אנתר מיוטי, תלבש כפפות ותלחץ בעדינות על הגבעול המוגדל בבליטה כדי לבדוק אם הוא רך מספיק לחתוך.
    הערה: פרוטוקול זה לקיבוע ואימונולוקליזציה יכול לשמש הן לניצני תירס והן לניצני פרחים מיוטיים של Arabidopsis thaliana (פחות מ-400 מיקרון). אבל במקרה של תירס, תלוי בזן בו משתמשים ובעונה בשנה (יש צמיחה מהירה יותר באביב), לוקח בערך 8 שבועות מהשתילה לקו B73 שנולד מוקדם, אבל רק 6 שבועות לקו הפריחה המוקדמת A344.
  2. הכנת בופרים.
    הערה: יום לפני קיבוע כימיקלים, הכינו את התמיסות היעילות הבאות, עשו זאת בזהירות ותייגו את כל הבקבוקים כראוי.
    1. הכינו 100 מ"ל מלחים של 10x Buffer A (BA), על ידי הוספת 4.53 גרם PIPES (פיפראזין-N, N′-ביס (2-אתנסולפוניק חומצה) בריכוז סופי של 150 מ"מ), 5.96 גרם KCl (ריכוז סופי 800 מ"מ), 1.17 גרם NaCl (ריכוז סופי 200 מ"מ), 0.74 גרם EDTA (ריכוז סופי 20 מ"מ), 0.19 גרם EGTA (ריכוז סופי 5 מ"מ) ו-90 מ"ל H2O, תחילה כוון את ה-pH ל-6.8–7 עם KOH, ואז כוון את הנפח ל-100 מ"ל.
    2. לבסוף, יש לחטא את המסנן באמצעות יחידת סינון סטרילית חד-פעמית Rapid Flow עם PES של 0.45 מיקרון (שמור על 4 מעלות צלזיוס אך לא להקפיא אותו; ניתן לאחסן אותו למספר חודשים).
    3. התכוננו:
      -50 mM PIPES (pH מותאם ל-7 עם KOH).
      - מאגרי תפירן בריכוז של 0.4 מ' (מומס בעבר בצינורות של 50 מ"מ, התאמת ה-pH ל-7 עם KOH, שמירה על אליקווט של 50 מיקרו-ליטר ב-20 מעלות צלזיוס).
      - מלאי ספרמידין בריכוז של 0.4 מ' (מומס ב-50 מ"מ פיפס, עם pH מותאם ל-7 עם KOH, שומרים על אליקואטים קפואים של 125 מיקרוליטר בטמפרטורה של -20°C).
      - מלאי דיתיוטרייטול (DTT) 1 M (מומס ב-0.01 מיליון נתרן אצטט, ל-pH 5.2, שומר על אליקוטים קפואים של 100 מיקרו-ליטר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס).
      - סורביטול 2 מטר, נשמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו 50 מ"ל של 2x בופר A (BA), על קרח, תוך שימוש ב-10 מ"ל מלחי בופר A של 10x (נשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס), 50 מיקרוליטר של זרם (0.4 מטר בצינורות 50 מ"מ, עם ההתאמה ל-pH ל-7 עם KOH), 125 מיקרוליטר של ספרמידין (0.4 מיליון בצינורות 50 מ"מ, עם ה-pH מותאם ל-7 עם KOH), 100 מיקרוליטר DTT (1 M ב-0.01 M נתרן אצטט, pH 5.2) מערבולת בעוצמה כדי להמיס; ואל תחמם.
    1. לאחר מכן, מוסיפים 16 מ"ל של סורביטול 2 מטר. כוון את הנפח הסופי ל-50 מ"ל עם מים סטריליים. חיטא מסנן באמצעות מסנן סטרילי חד-פעמי בזרימה מהירה ואחסן בטמפרטורה של 4°C.
  4. הכינו תא לח העשוי מ-5–10 מגבות נייר לחות המונחות בקופסת פלסטיק. בדוק שהמכסה אטום היטב. הסר מים עודפים.
  5. לאחר מכן, הניחו במגש את הפריטים הבאים: תא לח, להב גילוח, מלקחיים דקים (שעברו חיטוי עם 70% אתנול), בקבוק קטן של מים סטריליים, וסרט הדבקה. הביאו את המגש ותכולתו לצמחי התירס שנבדקו בשלב 1.1.
  6. השתמש בלהב גילוח כדי לחתוך את הגבעול הבולט בגובה התפרחת. ענפי הגדילים העיקריים, כמו גם הענפים הצדדיים של התפרחת, יכולים לשמש לקטיף פרחים מיוטיים.
    הערה: ענפי הגדילים הללו מכילים את הפרחים המעניינים לאיסוף אנתרים מיוטיים. כל פרח מכיל שישה אנתרים, ושלושת העליונים והגדולים משמשים בדרך כלל לניתוח. הגודל והצבע המשוגעים של האנקנים מתואמים לכל שלב מיוטי. אנתרים כמעט שקופים באורך של כ-1 מ"מ נמצאים בשלב הלפטוטנה, אנתרים שקופים באורך 1.5 מ"מ נמצאים בשלב הזיגוטנה, אנתרים לבנים באורך 2 מ"מ נמצאים בשלב הפכיטנה, ואנתרים צהבהבים באורך > 2 מ"מ עשויים להכיל מיוציטים בדיפלוטן, טטרדות וגרגרי אבקה שמסיימים את הגמטוגנזה. יש לשים לב שקורלציה נוספת בין שלב האורך יכולה להשתנות בין רקעים גנטיים של תירס, ושגורמים סביבתיים (למשל, טמפרטורה גבוהה) יכולים להאיץ את התקדמות המיוטית ולשנות קשר זה. מומלץ לחוקרים לאמת מתאמים של שלבי גודל אחרים עבור כל גנוטיפ תירס ספציפי ותנאי גדילה (באמצעות דחיסת אצטוקרמין, ראה 1.6).
  7. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לנתח ולאסוף בזהירות את הענפים הצדדיים של התפרחות ולעטוף אותם בתוך מגבת הנייר של התא הלח.
    הערה: עם קצת תרגול, נדרש רק חתך קצר ליניארי של 3–4 ס"מ בגבעול כדי להוציא את ענפי הגדיל המיוטי. ניתן לסגור את החתך הזה על ידי עטיפתו שלוש עד ארבע פעמים עם סרט מסיכה סטנדרטי, שמאפשר לקצור את אותו צמח מאוחר יותר באמצעות תפרחת שנותרה לא מפורקת. הרקמה תמשיך לגדול ומאוחר יותר עשויה לשמש להאבקה.
  8. שמור על התא בטמפרטורת החדר. השתמש רק בענפי התפרחת המכילים פרחים הנושאים אנתרים בשלב המיאוטי. ודאו לכסות את הענפים בחצי מהמגבות הלחות, אך אל טבלו אותם במים.
  9. הלח שוב אם המגבות מתייבשות. סגור את הקופסה עד לניתוח הקרנים, רצוי עד 30 דקות לפני תחילת איסוף האנתר.
  10. באמצעות מיקרומיקרוסקופ סטריאו בינוקולרי עם סולם מכויל, אספו אנתרים טריים מפרחים ל-2 מ"ל של 1x BA בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, כדי להבטיח זיהוי מדויק של שלבים מיוטיים באמצעות היחס לגודל וצבע האחר.
    הערה: כדי לקבוע במדויק את שלב המיוציטים באנתרים שנדגמו, אחד משלושה אנתרים מסונכרנים לכל פרח מנותח במהירות באמצעות קיבוע 3:1 של אתנול-חומצה אצטית, צביעת אצטוקרמין ומיקרוסקופיית דלעת מסורתית13.
  11. הכינו את ה-4% פורמלדהיד ב-1x BA ו-0.0025% Tween-20
    הערה: עבור 3 מ"ל, הוסף 750 מיקרוליטר פורמלדהיד 16%, 750 מיקרוליטר H2O,1.5 מ"ל 2x BA, ו-7.5 מיקרוליטר טווין-20 ב-1%.
  12. הסר את בופר ה-BA הראשוני והוסף את 3 מ"ל של התמיסה המקבעת הטרייה לאנתרים המדורגים ומקבע אותם במשך 45 דקות בתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 35 מ"מ, אטומה בפארפילם למניעת אידוי פורמלדהיד, ואז מניחים אותו על צלחת פטרי גדולה יותר המונחת על שייקר סיבובי (מוגדר על 40–60 סל"ד), או 0.2 x g). תעשה את זה בטמפרטורת החדר. ה-Anthers צריכים להסתחרר מעט בשביל קיבוע טוב. הם בדרך כלל צפים על פני המים.
  13. שטוף עם 3 מ"ל של 1x BA, ואז העבר את הדגימה לצלחת פטרי קטנה ומניח אותה על שייקר סיבובי (40–60 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
  14. באמצעות מלקחיים נקיים, העבירו את האנתר לצלחת פטרי קטנה בקוטר 35 מ"מ המכילה 3 מ"ל 1X BA טרי. אטום היטב את צלחת הפטרי עם פרפילם. לאחר מכן שמרו את צלחת הפטרי הקטנה בתוך צלחת פטרי, מכסים אותה בנייר אלומיניום כדי לשמור עליה בחושך, ומניחים אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אפשר לאחסן אותו לכמה חודשים במידת הצורך.

2. הטמעת מיוציטים של תירס בתוך כריכות כריך פוליאקרילאמיד

יום 1: הכנת שקופיות תלת-ממדיות

  1. הכינו 2 מ"ל תמיסת אקרילאמיד על ידי ערבוב נפחים שווים (1:1) של אקרילאמיד ו-2x BA. לפני הוספת נתרן סולפיט (NaS) ואמוניום פרסופט (APS), יש להסיר גזים מתמיסת האקרילאמיד תחת ואקום למשך 5–10 דקות.
  2. Alicot האקרילאמיד ויחס 2x BA 1:1 מתערבבים על ידי פיפטינג של 100 מיקרו ליטר לצינורות של 1.5 מ"ל.
    מספר הצינורות שתכין תלוי במספר השקופיות שתכין.
  3. תעשה 1 מ"ל ו-1x BA.
  4. הניחו חתיכות פאראפילם בגודל 2 ס"מ על 2 ס"מ מעל צלחת פטרי, ואז הניחו אותן תחת מיקרוסקופ ניתוח. פיפט 50 מיקרוליטר של תמיסת BA עם אנתרים על פאראפילם. גזום את קצה הפיפטה עם מספריים כדי להקל על העברת החלק האחר.
    1. פיפטה של 25 מיקרוליטר של תמיסת BA על פארפילם במקום אחר.
  5. באמצעות מלקחיים להחזיק אנתרים, חתכו את קצה האנתר עם סכין מנתח, וסוחטים בעדינות את המיאוציטים החוצה. עם פיפטה, העבר את המיוציטים בעדינות לטיפה של 25 מיקרו-ליטר BA וערבב בעדינות.
  6. פיפט 10 מיקרוליטר מתערובת המיאוציטים על משטח כיסוי נפרד.
  7. במהירות, פיפטה 5 מיקרוליטר של 20% (0.2 גרם / 1 מ"ל) NaS ו-5 מיקרוליטר 20% (0.2 גרם / 1 מ"ל) APS לצינור של 1.5 מ"ל עם Acrylamide/2x Buffer A.
  8. במהירות, פיפטה של 5 מיקרוליטר מהמקרה לעיל מתערבבת על כיסוי ומערבבת עם מיוציטים. הניחו כיסוי עם כיסוי פולי-אל-ליזין מעל, אך סובבו אותו 45 מעלות. שימוש בכיסוי פולי-אל-ליזין אחד בלבד (שהושג מסחרית או יוצר על ידי הטבלת כיסויי כיסוי בתמיסת פוליאל-אל-ליזין בצלחת פטרי למספר דקות ומתן לייבוש על שפת צלחת פטרי חדשה ונקייה) מסייע בשחרור כרית מלאה לאחר הפולימריזציה. הכיסוי מורם במהירות מהתמיסה ומייבש לפני השימוש. למיקרוסקופיה ברזולוציה על, יש להשתמש בכיסויי כיסוי בעלי ביצועים גבוהים בעובי סטנדרטי (≤170 ננומטר)14.
  9. אנא אל תיגעו בכיסויי הכיסוי למשך 30–50 דקות כדי לאפשר פולימריזציה מלאה של הדגימה בטמפרטורת החדר (תהליך פולימריזציה מהיר יותר מקצר את תקופת הייבוש של הפד, והאיכות המתקבלת פחות אופטימלית).
  10. חזור על השלבים '2.6–2.9' לכל שקף שתרצה להכין.
  11. הפרדו בזהירות את כל הכיסוי עם להב גילוח. הניחו את כל הכיסויים, בצד כלפי מעלה, על פד פוליאקרילאמיד (או רוב הפד), בפלטת 6 בארות.
  12. שטפו כל כיסוי עם כרית עם 2 מ"ל של מי מלח עם בופר זרחן (PBS) למשך 10 דקות. חזור על השטיפה פעם אחת, לזמן כביסה כולל של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. הכינו 50 מ"ל על ידי ערבוב 49.4 מ"ל PBS 1x, 100 מיקרוליטר EDTA 0.5 מ', ו-500 מיקרוליטר טריטון.
  14. שטוף כל כיסוי עם כרית ב-1 מ"ל של 1x PBS זה, בתוספת 1 מ"מ EDTA ו-1% טריטון למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  15. הכינו אצווה חדשה של בופר חסימה המכיל 1x PBS, 1 mM EDTA, 0.1% Tween-20, ו-3% BSA (1 מ"ל לשקופית). ל-50 מ"ל של בופר חסימה, יש לערבב 44 מ"ל PBS 1x, 100 מיקרוליטר EDTA 0.5 מ', 5 מ"ל של 1% תמיסת טווין-20, ו-1.5 גרם BSA. BSA מועדף על פני סרום חמור כסוכן חוסם כי הוא מסייע למזער אותות לא ספציפיים כאשר משתמשים בנוגדנים ראשוניים ומשניים מרובים.

3. אימונולוקליזציות

  1. הכינו נוגדנים ראשוניים (או נוגדנים) בדילול הרצוי באמצעות בופר חסימה. שלבו נוגדנים ראשוניים בהתבסס על יכולתם לייצר אותות מובחנים כאשר משתמשים בהם יחד. הם אמורים להגיע מאורגניזמים שונים, כמו ארנב, חולדה, חזיר ים או תרנגולת, שניתן לזהות אותם באמצעות נוגדנים משניים מסומנים פלואורסצנטיים ספציפיים. שימוש בנוגדנים לחמור או לעז נמנע משום שהם מיועדים לשימוש כנוגדנים משניים. אנו ממליצים להשתמש במין יחיד של נוגדן משני (למשל, עז בניסוי המוצג באיור 1).
  2. הוסיפו 50 מיקרולטר של נוגדן ראשוני מדולל זה למרכז כל כיסוי עם כרית.
    הוסף מים בין הבארות כדי להאט את האידוי. שים את הצלחת בתא לח (קופסה מפלסטיק עם מכסה). עזוב ללילה.

יום 2: כביסה

  1. הכינו 500 מ"ל של בופר שטיפה (1x PBS + 0.1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
  2. הסר את תמיסת הלילה מהבארות על ידי שאיבה עם הפיפטה.
  3. שטוף במהירות כל כיסוי עם כרית פעמיים עם 1 מ"ל בופר שטיפה, ואז הסר אותו מהבארות.
  4. פיפט עוד 1 מ"ל/כיסוי עם כרית ומשאיר שעה בטמפרטורת החדר.
    חזור על זה עוד 7 פעמים. (8 שעות בסך הכל)
  5. לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו מים בין הבארות, כסו את הצלחת, והשאירו אותה למשך הלילה בתא לח.

יום 3: נוגדנים משניים, שטיפות והתקנת שקופיות

  1. הכינו את הנוגדנים המשניים על ידי דילול כל אחד מהם ביחס של 1:50 בבופר חסימה.
    שאפו את תמיסת הכביסה. פזר 50 מיקרו-ליטר מהנוגדן המשני המדולל למרכז כל פד באמצעות פיפטה.
    הערה: כל נוגדן משני צריך לשמש בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים מובחנים עם אורכי גל פליטה שאינם חופפים. לדוגמה, נוגדן משני אחד צריך להיות מתויג ב-AlexaFluor488 (ירוק), הבא ב-AlexaFluor555 (כתום), והשלישי ב-AlexaFluor647 (אדום רחוק), שניתן לשלב עם DAPI (עירור ב-461 ננומטר, כחול). צבעים פלואורסצנטיים נוספים, כמו DyLight (של Dyomics GmbH), גם הם שימושיים. בנוסף, כל הנוגדנים המשניים הללו לא צריכים להגיב עם מינים אחרים המשמשים בתערובת נוגדנים ראשוניים. לדוגמה, יש להתאים את הנוגדן המשני נגד הארנב כך שיהיה סלקטיבי לנוגדנים לארנב ולא לזהות נוגדנים של חולדה או שפן. אותו הדבר נכון לגבי כל הנוגדנים המשניים. ניסוי מתוכנן היטב צריך לשמש לאימות כל הדרישות הללו בו-זמנית בעת ביצוע קו-אימונולוקליזציות.
  2. הוסיפו מים בין הבארות, הניחו צלחת בתא הלח, והשאירו שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. שאפו את התמיסה מהבארות.
  4. בצע ארבע שטיפות עם 1 מ"ל לבאר, שעה אחת כל אחת בטמפרטורת החדר (4 שעות בסך הכל).
  5. שטפו כל באר עם 1 מ״ל של 1x PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר וחזרו על התהליך פעמיים נוספות. (30 דקות בסך הכל)
  6. לדלל DAPI ב-1x PBS.
  7. צבע בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל דאפי (אבקת דאפי מומסת במים) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, והנח 500 מיקרוליטר לבאר.
  8. הסר את אנטי-פייד ProLong™ Gold מהמקפיא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לו להפשיר ולהגיע לטמפרטורת החדר.
  9. שטוף סלייד ב-1x PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם 1 מ"ל לבאר. תעשה את זה פעמיים שוב. (שעה וחצי דקה בסך הכל)
  10. הסר את הכביסה האחרונה.
  11. ואז הוסיפו שתי טיפות של ProLong™ Gold antifade באמצע כל פד.
  12. הרכבה את הכיסוי על כל שקופה, תייג כל שקופה, הרם את הכיסוי מהבאר עם מלקחיים דקים, ומניח אותם לאט על המגלשה. בעזרת מלקחיים דקים, הורד לאט כיסוי שני על הראשון. באמצעות שואב אבק, הסר גליצרול עודף מקצוות הכיסוי. אטום את קצוות הכיסוי בשתי שכבות לק.
  13. אם השקופיות לא נבדקות מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אחסן אותם במקפיא של מינוס 20°C, מוגן מאור, עד לתצפית. בהמשך, ניתן למגלשות לעמוד בטמפרטורת החדר במשך שעה בתוך קופסת סלייד, אופקית ובחושך, כדי למנוע עיבוי.

יום 4: תצפיות מיקרוסקופיות

  1. מתבונן בהחלקה מתחת לאורכי הגל והפילטרים הנכונים של העירור. מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית מספיקה, אך מומלץ להשתמש במיקרוסקופ עם מטרה של 60x כדי לאפשר הדמיה תלת-ממדית של כל התא באמצעות מחסנית z כל 0.2 מיקרון, עם רכישת תמונות רציפה ועיבוד דה-קונבולוציה באמצעות תוכנת Applied Precision SoftWoRx® .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בו-זמנית בדפוסי המיקום של שלושת החלבונים המיוטיים המרכזיים בתירס (איור 1). החלבון המיוטי ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) הוא הומולוג של תת-היחידה אלפא-קלייזין REC8 של קומפלקס הקוהזין המיאוטי. ה-ASYNAPTIC 1 (ASY1) הוא אלמנט אקסיאלי קריטי, בעוד שה-ZYPPER1 (ZYP1) הוא האלמנט הטרנסוורסלי של הקומפלקס הסינפטונלי15. צביעת DAPI מראה גרעין ברור וצביעת כרומטין, המאפשרת זיהוי של תת-השלבים המיוטיים, אך גם מראה צב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציע יתרון מרכזי על פני אחרים בכך שהוא שומר על נתונים תלת-ממדיים חיוניים על טעינת חלבונים כרומוזומליים מיוטיים. תכונות אלו אינן ניתנות לשימור באמצעות טכניקות התפשטות רגילות 1,2. עם זאת, לפרוטוקול זה יש שתי מגבלות: הוא איטי ודורש טכנית בהשוואה לטכניקות הפצה רגילות שמבוצעות בתוך יום אחד. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו דורש ארבעה ימי עבודה, בעיקר בשל שלבי שטיפה נרחבים ודגירה לילית של נוגדנים ראשוניים ומשניים, שלא ניתן לקצר או...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאדריאנה מונסראט על ניהול מנהלי ורכש. א. רונסרט מודה במענקים מ-UNAM-PAPIIT ו-SECIHTI, ומודה למכון לביוטכנולוגיה (IBt-UNAM) על המימון הראשוני והשנתי. פ. בולאנוס מודה לסגן הרקטור למחקר באוניברסיטת קוסטה ריקה על התמיכה המתמשכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 mL microtubes AxygenCorningMCT-150-C
15 mL Falcon tubesThermo Fisher Scientific339651
50 mL Falcon tubesThermo Fisher Scientific339652
6 well plate Falcon polystyrene microplateThermo Fisher Scientific 08-772-1B
Acetic acid, 60% Thermo Fisher ScientificA38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1Biorad1610157
Aluminum foldReynolds U07211R0
Amonium Persulfate (APS)MerckA3678
Binocular stereomicroscopeNANA
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck A9418
DAPIMerckD9542
DelltaVision microscopeOlympusNA
Distilled H2ONANA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm poreThermo Fisher Scientific/Nalgene09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SSFine Science Tools 11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647InvitrogenA-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568InvitrogenA-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488 InvitrogenA-11073
GlovesMerckZ412392
Growing chambers / greenhouse / or fieldNANA
DTTMerckD0632
EDTASigma-AldrichE6758
EGTASigma-AldrichE3889
KClSigma-AldrichP3911
Masking tape 3MFisher Scientific19-047-259
Maize seedsNA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips Fisher Scientific12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips Deckgläser, Zeiss474030-9020-000
Microscopic glass slidesFisher Scientific22-230-900
Microscope slide boxFisher Scientific,03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000MerckCLS4069
NaClMerckS7653
Nail polishElectron Microscopy Science72180
Paper towelsMerckZ188956
ParafilmMerckP7668
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Grade 15710
PBSMerckP4474
Plastic box with lidTupperwareNA
Poly-L-LysineMerckP4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)NA
Prolong AntifadingMolecular ProbesP36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mmCorning351008
Petri dish regular sizeMerckP5731
PIPESMerckP1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile Merck/CorningAXYT300
Pipet tips (200 uL) sterileMerck/CorningAXYT200Y 
Pipet tips (1000 uL) sterileMerck/CorningAXYT1000BRS
Razor blade - single edgedFisher Scientific12-640
Rocking platform shakerNANA
SpermineMerck85590
Spermidine MerckS2626
SorbitolMerckS8143
Tween-20MerckP9416
Triton X-100Fisher Scientific9002-93-1
Ultra pure AcrylamideInvitrogen15512023
Vacuum

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים