מאמר שיטה

פרוטוקול למעקב וכימות התנהגותי אוטומטי בדרוזופילה מלנגסטר

DOI:

10.3791/71417

⸱

24 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine; Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases; Guangdong Provincial clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology; Guangdong Hong Kong-Macao Greater Bay Area Higher Education Joint Laboratory of Maternal-Fetal Medicine; The Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical College, Guangzhou Medical University, 3School of Health Management, Guangzhou Medical University, 4School of Marxism, Guangzhou Medical University, 5The Fifth Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש בהערכת תנוחה באמצעות פייתון כדי לעקוב אחר נקודות גוף מרכזיות בדרוזופילה זוגית, ומקל על כימות אוטומטי של התנהגויות חברתיות עדינות, במיוחד באינטראקציה חברתית, וכן במפות חום ומסלולי תנועה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לפתח כלי אנליטי בקוד פתוח המתגבר על המגבלות של שיטות מעקב מסורתיות מבוססות סנטרואידים, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מדויק של אינטראקציות חברתיות בזוגות דרוזופילה הפועלים בחופשיות. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מושפע ממסגרת הרשת ברזולוציה גבוהה (HRNet) שמטרתה לעקוב בו-זמנית אחרי חמישה נקודות מפתח אנטומיות — ראש, חזה, בטן וקצות אגף שמאל וימין — במטרה לייצר נתוני קואורדינטות ברזולוציה גבוהה לניתוח כמותי נוסף של התנהגויות חברתיות. פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מלא המבוסס על פייתון וממשק משתמש גרפי (GUI) שעיצבנו, כולל בניית מערכי נתונים, אימון מודלים וחילוץ קואורדינטות אוטומטי, לצד מודולים משולבים ליצירת מפות חום לתפוסה מרחבית, מסלולי תנועה ויחסי אינטראקציה חברתית בזבובים. כדי לאמת מסגרת זו, היא נבדקה באמצעות שני זנים נפוצים, w1118 ו-Canton-S (CS). התוצאות שלנו הדגימו את יציבות זיהוי נקודות מפתח וחשפו הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בשימוש מרחבי ובמבנה הקטר. מתודולוגיה זו מספקת בסיס ניתן להרחבה לאתולוגיה כמותית ולניתוח אוטומטי של אינטראקציות חברתיות בדרוזופילה, תוך הפחתת מאמץ ההערות הידניות ושיפור השחזוריות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרוזופילה מלנגסטר הוא אורגניזם מודל נפוץ עם כלים גנטיים רבי עוצמה ומעגלים עצביים ממופים היטב המאפשרים ניתוח מכני של התנהגות1. יש לו מגוון רחב של התנהגויות חברתיות, כולל חיזור ותוקפנות, ויכולת למידה חזקה 2,3,4,5,6,7,8. כל אחד מהם מורכב מאלמנטים מוטוריים מובחנים הנשלטים על ידי מערכת עצבים קומפקטית אך מאורגנת היטב. חשוב לציין שמדידה מדויקת של יציבת הגוף חיונית להבנת היסודות הנוירולוגיים של בחירת פעולה, שכן רבות מההתנהגויות הללו מכילות מוטיבים מדויקים של יציבה שמקודדים מידע הקשרי ומצב פנימי 9,10.

למרות הצורך ברזולוציית זבוב יחיד כדי ללכוד הבדלים בודדים, רבות מהבדיקות ההתנהגותיות בעלות תפוקה גבוהה בדרוזופילה עדיין מסתמכות על מדדים ברמת קבוצה11. בדיקות התנהגות בעלות תפוקה גבוהה כוללות בדיקות T-maze להעדפה חברתית 12,13, בדיקות רווח חברתי שמכימות מרחק בין זבובים, או פרדיגמות הצטברות/הימנעות תחת גירוי חושי14 שיכולות ללכוד ביעילות מגמות אוכלוסייה. עם זאת, הן כרוכות במהותן ממוצע בין יחידים, ובכך מטשטשות הטרוגניות ברצפי פעולה ובמבנה הזמן של חילופי הדברים החברתיים. במהלך השנים, ניסיונות להתקדם לזיהוי לפי זבוב הסתמכו על שיטות מוגבלות פונקציונלית, כגון זיהוי אירועים מבוסס כללים באמצעות ספי קינמטיים, חיסור רקע באמצעות מעקב מרכזי, והערות וידאו ידניות 15,16,17,18. כתוצאה מכך, התנהגויות נפרדות כמו זינוק, טפיחה או איומי כנפיים לעיתים קרובות מתעלמים מהן או מסומנות לא נכון, מה שמצריך תיקון ידני משמעותי. מגבלות כאלה הגבילו מחקרים מכניים שדורשים יישור זמני מדויק בין פעילות עצבית לפעולות אישיות.

פתרון מהפכני זמין כעת בזכות התפתחויות אחרונות בראיית מחשב והערכת תנוחה מבוססת למידת מכונה. מסגרות קוד פתוח כמו DeepLabCut19 ו-SLEAP20 מאפשרות זיהוי חלקי גוף ללא סימנים, סיווג ניתן להרחבה של פעולות נפרדות, ושימור זהות אישית גם במהלך אינטראקציות קרובות. תכונות אלו מתגברות על החסרונות של גישות מבוססות קבוצה וכללים קודמות ומאפשרות כימות חוזר של התנהגויות חברתיות מורכבות.

אינטראקציות אישיות בדרוזופילה מאופיינות בתכונות מוטוריות ייחודיות המצביעות על התקדמות האינטראקציות החברתיות. תוקפנות, למשל, כוללת התנהגויות טיפוסיות כמו קפיצה, איומי כנפיים ואחיזה, שכולן מייצגות שלבי קונפליקט הולכים וגדלים21,22. חיזור מוגדר באופן דומה על ידי אוריינטציה, הארכת כנפיים חד-צדדית עם הפקת שירה, נקישות וניסיונות להזדווגות, שמתחברים ליצירת רצף זמני של אינטראקציות הזיווג23. לכידת המוטיבים הללו תלויה בזיהוי מדויק של יציבת הגוף ותנועות מפרקים24,25. בפועל, דגימה דורשת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה לאורך תקופות הקלטה ממושכות כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות וליישר דפוסים מוטוריים עדינים במדויק עם פעילות עצבית25,26.

כאן, אנו מציגים מסגרת קוד פתוח, מבוססת ראייה, לזיהוי אוטומטי של חמש נקודות מפתח אנטומיות—ראש, חזה, בטן, קצה אגף שמאל וימין27. המערכת כוללת תהליך עבודה מלא לבניית מערכי נתונים, אימון מודלים וחילוץ קואורדינטות, ומפיקה נתוני סדרות זמן ברזולוציה גבוהה המתאימים לסיווג התנהגותי מותאם אישית. על ידי אוטומציה של תהליכי הערות ידניות וסטנדרטיזציה של תהליכי עבודה אנליטיים, השיטה שלנו מאפשרת ניתוח כמותי בקנה מידה עדין של התנהגויות אינטראקציה חברתית, מה שמגביר את היעילות והשחזוריות תוך הפחתה משמעותית של הזמן והעבודה הנדרשים לניתוח.

כדי לאמת את אמינות המערכת, יישמנו אותה על שני זנים נפוצים במעבדה, w1118 ו-Canton-S (CS), וזיהינו זיהוי יציב של נקודות מפתח בין מסגרות, וכן הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בתפוסה מרחבית, מאפייני מסלול ומדדי אינטראקציה חברתית בהתבסס על מרחק ראש וזווית כיוון. חוקרים יכולים להעריך את ההתאמה של פרוטוקול זה בהתבסס על רזולוציית מרחב-זמן נדרשת (≥30 fps, ≤0.5 מ"מ/פיקסל) ותנאי הקלטת וידאו (תאורה וניגודיות). גודל הפיקסל ניתן לקבוע ישירות מהגדרות המצלמה. זבוב פירות עם אורך גוף מדוד יכול להיות ממוקם בשדה הראייה לצורך כיול. פרוטוקול זה מתאים במיוחד לתרחישים הבאים: הצורך לעקוב בו-זמנית אחרי שתי דרוזופילה הפועלות בחופשיות ולהבחין בזהות האישית שלהן; התמקדות ביציבות עדינות (למשל, זווית ראש ומרחק) במקום רק במיקומי המרכז; משך הקלטה העולה על 10 דקות כאשר לא ניתן לבצע הערות ידניות; נדרש יישור זמני ברמת אלפיות שנייה בין אירועים התנהגותיים לפעילות עצבית (למשל, הדמיית סידן או אלקטרופיזיולוגיה) בניתוחים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת זבובים

  1. איסוף ומין של הזבובים בגיל 3–4 ימים תחת הרדמה קצרה של CO₂ לפני הניסויים.
    הערה: משך ההרדמה וקצב זרימת CO₂ עשויים להשתנות בהתאם למפרט וללחץ של גליל הפחמן הדו-חמצני המשמש בכל מעבדה. יש לעקוב אחרי זבובים באופן רציף במהלך ההרדמה, ולשמור על חשיפה ל-CO₂ רק עד שהזבובים יורדמו במלואם ויפגינו הפסקה מוחלטת של תנועה.
  2. הניחו כל זבוב בנפרד בתוך צינור Falcon בנפח 50 מ"ל המכיל מדיום סטנדרטי של קמח תירס–אגר–גלוקוז–שמרים.
  3. שמרו על זבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור אור/חושך של 12 שעות עד השימוש.

2. בניית הזירה

  1. הכינו שני לוחות אקריליק שקופים בקוטר 3 מ"מ ולוח פוליאתילן אחד בקוטר 3 מ"מ.
  2. חתוך ארבעה תאים עגולים (קוטר 35 מ"מ כל אחד) במרכז פלטת הפוליאתילן.
  3. השתמשו בקליפים כדי להדביק פלטת אקריליק אחת לפלטת הפוליאתילן ליצירת בסיס החדר; שמור על הפלטת האקרילית השנייה ככיסוי נשלף.

figure-protocol-1
איור 1: סכמטי של תחום ההתנהגות והגדרת הדמיה. (א) בניית חדר תצפית מותאם אישית מוצגת בדיאגרמה. התא מורכב משלוש שכבות עיקריות: לוח בסיס אקרילי שקוף בקוטר 3 מ"מ; לוח פוליאתילן בקוטר 3 מ"מ עם ארבעה חיתוכים עגולים בקוטר 35 מ"מ המשמשים כבארות תא נפרדות; ולוחית אקרילית שנייה המשמשת ככיסוי נשלף. (ב) מהדק מתאם 90° משמש להתקנת המצלמה אנכית על עמוד אופטי בקוטר 40 ס"מ. לצילום מלמעלה למטה, המצלמה ממוקמת ישירות מעל זירת התצפית הרב-שכבתית, כאשר הציר האופטי שלה ניצב על פני שטח התא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הגדרת הדמיה

  1. הרכיבו שני עמודי אופטיקה בקוטר 20 ס"מ ועמוד אחד בקוטר 40 ס"מ עם מהדקי מתאם בזווית 90°.
  2. התקן את המצלמה (1280 × 1024 פיקסלים) אנכית על עמוד ה-40 ס"מ, מיושר בניצב למשטח הזירה, וקבע את קצב הפריימים ל-150 fps.
  3. הניחו את הזירה על פאנל LED לבן באור יום בגודל 25 ס"מ × 25 ס"מ, המכוסה בדף דיפוזיה.
  4. כוון את התאורה לכ-1500 לוקס על פני האולם.
    הערה: ודא שקצוות הכנפיים נשארים גלויים בתצוגה הבינארית. הימנעו מ->2000 לוקס כדי למנוע ארטיפקטים שנגרמו מחום, שכן זבובים עלולים לשנות את תנועתם הטבעית או את התפלגותם עקב מאמץ תרמי ממקור האור.

4. הליך הקלטה

  1. הניחו רפידות קצף בקוטר 3 ס"מ מתחת לכל פינה של הזירה כדי לייצב אותה.
  2. מעבירים זוגות זבובים תחת הרדמה CO₂ לחדרים; אטום עם הפלטת האקרילית העליונה.
  3. תן לזבובים להסתגל ל-40 דקות לפני ההקלטה.
  4. התחל ברכישת וידאו באמצעות MIAS.exe27: לחץ על q כדי להתחיל ו-C כדי לעצור.
    הערה: זה מוביל להקלטות וידאו רציפות של זוגות זבובים הפועלים בחופשיות בתנאים סטנדרטיים.

5. הגדר את פאנל הפעילות החברתית

  1. הרץ את סקריפט הקדם-עיבוד: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
    הערה: כל סקריפטי הקידוד מסופקים בקובץ משלים 1.
  2. יש להוסיף הערות לאזור התא ולהקצה מטא-דאטה בצורת Genotype_age (ימים) × 1 (מספר חדרים). (למשל, CS_3 × 1)
  3. כוון את סרגל הזיהוי עד שהכנפיים כמעט בלתי נראות בתמונה הבינארית כדי להבטיח חיסור אופטימלי ברקע ונראות כנפיים.

6. הכנת מערכי נתונים

  1. צור תיקיית סט נתונים חדשה על ידי הרצה:
    PYTHON tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (מרווח דגימת פריימים)
    הערה: פרמטר מרווח דגימת המסגרת ("10") הותאם מפרוטוקול27 שפורסם בעבר. ערכים נמוכים מעלים צפיפות דגימה ועומס חישוב, בעוד שערכים גבוהים מפחיתים את הביקוש החישובי וניתן להתאים אותם בהתאם לביצועי חומרה זמינים ולדרישות ניסוי.
  2. הגדר נתיב וידאו ונתיב סט נתונים ב'כלים/SoAL_DatasetUtils.py'
  3. הפעלת ממשק תיוג ידני:
    >python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
    1. ניווט במסגרת: לחץ על מקש הרווח או מקש Z כדי לנווט לפריים הבא או הקודם, בהתאמה. חלופה נוספת היא להשתמש במחוון ציר הזמן לניווט.
    2. סימון נקודות מפתח: לחץ על המיקום הנכון של זבוב בכל תמונה (ברצף מסוים: ראש, חזה, בטן, כנף שמאל וכנף ימין) כדי לסמן את 5 נקודות המפתח.
    3. בחירת נקודת מפתח: לחץ על מקשי מספר כדי לבחור נקודת מפתח (מסומנת בעיגול לבן). הלחיצה הבאה תקצה מחדש מספר חדש לנקודת המפתח שנבחרה.
    4. שמירה: סגור את החלון או לחץ על מקש D כדי לשמור את תוצאות ההערות.
      הערה: ארכיון סט אימון מלא מורכב משני רכיבים: תיקיית תמונות וקובץ annotation.json.

7. אימון מודלים

  1. חלק את מערך הנתונים למערכי אימון ואימות:
    Python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME divide
    שתי תיקיות חדשות ייוצרו ב-'dataset/.'
  2. הגדר פרמטרי אימון ב-hrnet/fly_w32.yaml:
    מקדם סיבוב: 15°
    מקדם קנה מידה: 0.35
    מקדם בהירות: 0.25
    גודל אצווה: 24
    תקופות: 200
  3. הפעילו את תוכנית ההדרכה:
    Python HRNET/tools/train.py --CFG HRNET/fly_w32.yaml
    סיום מערכי אימון כאשר רמת דיוק ממוצע (AP) מגיעה; לשמור על המודל הטוב ביותר (AP > 90%).
  4. אימות מודל באמצעות:
    Python HRNET/tools/test.py --CFG HRNET/fly_w32.yaml
    תוצאה: מודל מבוסס HRNet חזק לזיהוי נקודות מפתח מרובות זבוב.

8. הרץ את תוכנית הגילוי

  1. העתק קבצי וידאו חדשים לתיקיית הווידאו.
  2. הערות על מטא-דאטה כפי שמוצג בשלב 5.
  3. הרצת תוכנית גילוי: פייתון SoAL_KptDetect.py הכל
  4. בדוק תוצאות גילוי:
    Python Tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
    תוצאה: קואורדינטות דו-ממדיות של חמישה נקודות ציון אנטומיות לכל טיסה בין מסגרות.

9. כימות התנהגותי

  1. הפעיל אפליקציית מעבד גרפי עצמאית לניתוח (קובץ משלים 2) וייבא קבצי קואורדינטות לממשק.
  2. יצר מפות חום לתפוסה מרחבית (צפיפות הסתברות של מיקומי הזירה).
  3. שחזור מסלולי תנועה מתוך סדרות זמן קואורדינטות.
  4. צור נתוני אינטראקציה חברתית, כולל מרחק ראש, נטייה ומצב חברתי נגזר.
    תוצאה: ויזואליזציה סטנדרטית של שימוש מרחבי ספציפי לגנוטיפ ודינמיקת תנועה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 ממחיש את גאומטריית הזירה, תצורת התאורה ומיקום המצלמה המשמשות לתיעוד אינטראקציות חברתיות טבעיות בדרוזופילה. ההתקנה מבטיחה תאורה אחידה ותנאי הדמיה יציבים המתאימים להערכת תנוחה ולחילוץ קואורדינטות.

הערכת תנוחה אוטומטית יושמה על כל הסרטונים המוקלטים כדי להפיק קואורדינטות דו-ממדיות לנקודות מפתח אנטומיות מוגדרות מראש של כל זבוב. המודל זיהה בעקביות את מפרקי הראש, החזה, הבטן והכנף בין מסגרות, אפילו במהלך אינטראקציות בטווח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שלנו מראה שהערכת תנוחה מבוססת למידת מכונה מספקת שיטה אמינה וניתנת להרחבה למדידת אינטראקציות חברתיות מדויקות בדרוזופילה. היא מתגברת על המגבלות של גישות מבוססות סנטרואידים 15,16,17,18 על ידי מעקב אחרי חמש נקודות מפתח אנטומיות בזוגות הפועלים בחופשיות, ומאפשרת רכישת מידע זוויתי המסופק על ידי ציר הגוף ומרחק ראש לראש המוסקת מנקודות ראש. הטכניקה שלנו י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים פיננסיים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ג'ינגיואן ג'אנג בבית הספר לתארים מתקדמים באוניברסיטת הרפואה של גואנגג'ואו על סיפוק ותחזוקת מערכת ההדמיה.

מימון: פרויקט התחומים הרפואיים המרכזיים של גואנגג'ואו (2025-2027)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרBioFroxx8211GR500
מצלמה(MV-CU013-A0UC)HikvisionMV-CU013-A0UC
פחמן דו-חמצניMesser124-38-9
D(+)-Glucose anhydrousBioFroxx1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)Biolgix51-0500
EthanolChron Chemicals64-17-5
לוחית LED//בהתאמה אישית
MethylparabenSigma99-76-3
צלחת פוליאתילן//בהתאמה אישית
Python/גרסה 3.6
סוכרוזDaMao57-50-1
לוחיות אקריליות שקופות//בהתאמה אישית
שמריםAngel100004237033

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233DrosophilaHRNet

מאמרים קשורים