סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

סיכום

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

תקציר

ביו-ייצור תעשייתי מסתמך על מיקרואורגניזמים כדי לסנתז ביעילות מוצרים מטרה בתנאים מהונדסים. עם זאת, זנים מסוג פראי לעיתים קרובות חסרים את היכולת לעשות זאת בשל רשתות המטבול הטבעיות שלהם. לכן, סינון מהיר ומדויק של זנים בעלי ביצועים גבוהים מספריות מוטנטים בקנה מידה גדול הוא שלב קריטי בגידול מיקרואורגניזמים תעשייתיים. בשנים האחרונות, טכנולוגיית מיקרופלואידיק לטיפות זכתה לתשומת לב רבה בשל יכולות ההפרדה הגבוהה, הצריכה הנמוכה והחלוקה לתא יחיד, מה שהוביל לפיתוח מערכות מיון חד-תאיות רבות. פרוטוקול סינון בעל תפוקה גבוהה לזנים מיקרוביאליים תעשייתיים באמצעות פלטפורמת מיקרופלואידיקה אוטומטית של טיפות מוצג במחקר זה. תהליך העבודה המשולב כולל ארבעה שלבים מרכזיים: בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של פלזמה אטמוספירית וטמפרטורת חדר (ARTP); קפסולציה חד-תאית יעילה ומיקרו-גידול מבוקר בתוך טיפות בקנה מידה פיקוליטר; הזרקת פיקו מדויקת של חיישן ביולוגי פלואורסצנטי, ואחריה מיון טיפות מופעלות על ידי פלואורסצנציה (FADS) לבידוד טיפות המכילות וריאנטים בעלי ייצור גבוה; ואימות הזנים המועמדים הממוינים באמצעות תסיסה של מיקרופלט ושייק-פלאסק. תהליך סינון מלא ומשולב מיועד לשמש כתבנית סטנדרטית, והאימות שלו מודגם באמצעות בידוד מוטנטים המייצרים חומצה L-לקטית בעלת תפוקה גבוהה של B. coagulans כדוגמה ספציפית. פלטפורמת הסינון האוטומטית והגבוהה הזו מציעה פתרון טכני עוצמתי עם פוטנציאל משמעותי להאיץ את ההתפתחות התעשייתית של זנים בעלי ביצועים גבוהים.

מבוא

ביוטכנולוגיה תעשייתית משתמשת במיקרואורגניזמים ואנזימים כביוקטליזטורים לייצור מוצרים יקרי ערך בקנה מידה גדול. גישה זו נחשבת לידידותית לסביבה ויעילה יותר מייצור כימי מסורתי. עם זאת, רשתות המטבוליזם הטבעיות של המיקרואורגניזמים התפתחו כדי להעדיף את הישרדותם ורבייתם שלהם במקום לסינתזה יעילה של מוצרים שבני אדם רוצים. כתוצאה מכך, רבייה מיקרוביאלית בתפוקה גבוהה היא לעיתים קרובות נחוצה כדי לעמוד בדרישות סביבות ייצור תעשייתיות עם תנאים מחמירים ^1,2,3. תהליך זה כולל בנייה מהירה של ספריות מוטנטים מיקרוביאליות בקנה מידה גדול באמצעות מוטגנזה פיזית או כימית, ולאחר מכן גידול וזיהוי פנוטיפי של מוטנטים עם גנוטיפים מובחנים. רק חלק קטן מהזנים העליונים נבחרים לאחר מכן. עם זאת, טכנולוגיות סינון מסורתיות מבוססות לוחות ומיקרופלטות מוגבלות בשל הליכים מסורבלים, תפוקה נמוכה ועלות גבוהה. צוואר בקבוק זה, יחד עם הצריכה המשמעותית של מוצרי צריכה ותגובות, מוביל ליעילות כוללת נמוכה של רבייה מיקרוביאלית ^4,5.

מיקרופלואידיקה של טיפות הפכה לאחרונה לפתרון משנה צורה לאתגר זה. בניגוד למיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS), שאינו מתאים לסינון תוצרים מופרשים עקב דיפוזיה מהירה של מולקולות הרחק מהתא, מיון טיפות מופעלות בפלואורסצנציה (FADS) עוטף תאים בודדים במיקרו-ריאקטורים מחולקים בקנה מידה פיקוליטר ^6,7,8. בידוד פיזי זה מונע תחרות זן, מאפשר הצטברות מקומית של מטבוליטים מופרשים, ומאפשר זיהוי כמותי באמצעות חיישנים ביולוגיים פלואורסצנטיים. כתוצאה מכך, FADS הוכיח את עצמו כפלטפורמה אידיאלית לסינון מהיר של מוצרים חוץ-תאיים שונים, כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות ואנזימים. צוות פיתח את החיישן הביולוגי המקודד גנטית GECFINDER, ובשילוב עם FADS הם הצליחו לסנן זנים המייצרים פנילאלנין גבוה ושיפרו את יעילות הסינון ביותר מ-1000^פעמים. קבוצה נוספת הקימה פלטפורמת מיון טיפות המופעלת על ידי פלואורסצנציה יחד עם חיישן ביולוגי מקודד גנטית לסינון מהיר של זנים המייצרים 3-דה-הידרושיקימיק חומצה ב-E. coli, ומערכת FADS האופטימלית שיפרה משמעותית את יעילות הסינון ואפשרה בידוד זנים מוטנטיים עם ייצור מוגבר משמעותית¹⁰. חלק מהחוקרים יישמו טכנולוגיית FADS להנדסת Bst DNA פולימראז, והמוטנטים שנרכשו עם יציבות תרמום משופרת ופעילות הזזת גדלים יושמו עוד בזיהוי LAMP (LAMP SL), מה שהקטין את זמן התגובה מ-40 דקות ל-10 דקות^ו-11.

עם זאת, תרגום ההתקדמות הטכנולוגית הזו לתהליכי פיתוח תעשייתיים שגרתיים נותר מאתגר. מערכות מיקרופלואידיות רבות לטיפות מסחריות, למרות החומרה המתקדמת שלהן, חסרות הליך פעולה סטנדרטי מלא, אינטואיטיבי וניתן לשחזור, המותאם לסינון פנוטיפי מיקרוביאלי. כדי להתמודד עם פער זה, אומצה פלטפורמת מיקרופלואידיק טיפות אוטומטית המשלבת בקרה נוזלית מודולרית, תוכנה ידידותית למשתמש ועיצוב שבב סטנדרטי, שהניחה בסיס טכני אידיאלי להקמת תהליך סינון משולב לחלוטין. מחקר זה משתמש בסקר בתפוקה גבוהה של B. coagulans המייצר חומצה L-לקטית בתפוקה גבוהה כמקרה אימות. בהתבסס על פלטפורמת מיקרופלואידיק טיפות, הוקם תהליך העבודה הבא, הכולל ארבעה שלבים מרכזיים ברצף: (1) בניית ספריית מוטנטים מגוונת באמצעות מוטגנזה של פלזמה אטמוספירית וטמפרטורת חדר (ARTP); (2) קפסולציה חד-תאית ביעילות גבוהה ומיקרו-גידול מבוקר בתוך טיפות בתנאים מותאמים לצמיחת B. coagulans ולייצור חומצה L-לקטית; (3) הזרקת פיקו מדויקת של חיישן ביולוגי פלואורסצנטי ספציפי ל-L-לקטט, ואחריה מיון מהיר של טיפות העוטפות יצרנים עליונים; ו-(4) אימות קפדני של מועמדים ממוינים באמצעות תסיסת שייק-פלאסק לאישור ייצור מוגבר ויציבות גנטית. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים ומהנדסים העוסקים ברבייה תעשייתית של מיקרואורגניזמים הזקוקים לסינון מהיר של מוצרים חוץ-תאיים. הוא מתאים במיוחד לחיידקים הניתנים לעיבוד שמפרישים מטבוליטים או אנזימים של מולקולות קטנות. פלטפורמת הסינון חייבת להיות מצוידת בחיישנים התואמים למיקרו-סביבת הטיפות כדי לאפשר זיהוי ספציפי של המטבוליטים המטרה. לזנים עם דרישות גידול מיוחדות (למשל, אנאירובים קפדניים), ניתן להתאים את פרמטרי הגידול לאופטימיזציה ולקבוע אסטרטגיית גידול ייעודית. על ידי הקמת תהליך סינון סגור וסטנדרטי זה, מחקר זה שואף לספק פתרון עוצמתי וניתן להעברה להאצת הרבייה התעשייתית של זנים.

פרוטוקול

לא נדרש אישור אתי למחקר זה. כל הניסויים נערכו באמצעות תרביות מיקרוביאליות טהורות, ולא היו מעורבים במחקר זה נבדקים אנושיים או בעלי חיים במעבדה. ראו את טבלת החומרים לפרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול הבא.

1. הכנות

אזהרה: פעלו לפי נהלי בטיחות ביולוגית. B. coagulans הוא אורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית 1. תלבש כפפות וחלוק מעבדה. בצע את כל המניפולציות הפתוחות בתוך מכסה זרימה למינרי. אוטוקלב לכל החומרים שבאים במגע עם תאים חיים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני ההשלכה.

1. מקור המתח ותחזוקה
   1. רכש את B. coagulans ATCC 7050 ממרכז איסוף תרביות מסחרי כדור שני של תרבות זויה.
   2. פזר לולאה של תרבית השיפוע על האגר הבינוני של הזרע ודוגר בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. קטף מושבה אחת, הסנן אותה לתוך מדיום זרעים נוזלי, וגדל בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 12 שעות.
   3. מערבבים את התרבית המתקבלת עם גליצרול סטרילי 40% לריכוז סופי של 25% (v/v) ואחסנו כמלאי קפוא בטמפרטורה של –80°C. בכל ניסוי, יש להפשיר אליקו טרי, לפזר אותו על אגר בינוני זרעים, ולדגור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   4. לאחר מכן בוחר מושבה אחת, מסנן אותה לתוך מדיום זרעים נוזלי, ומגדל בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 12 שעות לפני השימוש למוטגנזה וסינון (איור משלים 1).
2. חיישן חומצה לקטית
   1. הביטוי וטוהרו את חיישן eLACCO1.1 כפי שמתואר בחומרים משלימים¹² (איור משלים 2).
   2. הוסיפו לחיישן המטוהר גליצרול של 5% (v/v) ואחסנו אותו בטמפרטורה של –80°C. לכל ניסוי, יש להפשיר אליקו אחד על הקרח ולדלל אותו מיד עם PBS סטרילי של 10 מ"מ (pH 7.4) לריכוז עבודה סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל.
3. הכנת מדיה תרבותית
   1. מדיום זרעים (גרם/ליטר: גלוקוז 20, תמצית שמרים 5, טריפטון 10, אצטט נתרן 2, נתרן ציטראט 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4.7H 2}O 0.2, MnSO₄· H₂O 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.01). חטא את הגלוקוז בנפרד כמאגר של 200 גרם לליטר בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      1. אוטוקלב את שאר הרכיבים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הקירור, הוסף חומר גלוקוז סטרילי לריכוז סופי של 20 גרם לליטר, ואז מסנן את יסודות הזירה.
      2. אחסן את כל המדיום ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. שימוש להפעלה לילה, הכנת חינונים.
   2. מדיום סקר (גרם/ליטר: גלוקוז 20, תמצית שמרים 6.66, NaCl 0.333, NH₄Cl 0.665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4.46, MgSO₄ 0.12, CaCl₂ 0.074).
      1. חטא את הגלוקוז בנפרד בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אוטוקלב את תערובת תמצית המלח/שמרים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      2. לאחר הקירור, הוסף את ציר הגלוקוז הסטרילי ל-20 גרם לליטר. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. משתמשים בו כשלב מימי ליצירת טיפות וכמדיום תרבית בתוך הטיפות במהלך הדגירה של 10 שעות.
   3. מדיום תסיסה (גרם/ליטר: גלוקוז 90, טריפטון 13.33, תמצית שמרים 13.33, אצטט נתרן 0.67, NaCl 0.0133, MgSO_4.7H₂O 0.0133, MnSO₄· H₂O 0.0133, FeSO₄·7H₂O 0.0133).
      1. סטריליזציה של גלוקוז כמלאי של 500 גרם לליטר בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אוטוקלב את שאר הרכיבים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      2. לאחר הקירור, הוסיפו את מאגר הגלוקוז הסטרילי ל-90 גרם לליטר. הוסיפו אבקת CaCO₃ סטרילית (4% ל-v/v) ממש לפני ההזרקה כדי לאזן pH. הכינו טרי מדי יום. שימוש לסינון מיקרופלט ראשוני ואימות שייק-פלאסק.
         הערה: הכינו את כל המדיה עם מים מזוקקים לנפח סופי של 1 ליטר. כוונו את ה-pH ל-6.5 עם 1 M HCl.

2. בניית ספריית מוטנטים באמצעות ARTP

אזהרה: הפעלת ARTP כוללת פלזמה בתדר גבוה ומנורת UV. קרינת UV עלולה לגרום לפגיעות בעיניים ובעור. פליטת פלזמה מייצרת אוזון וטמפרטורות גבוהות. תמיד תשמור על דלת התא סגורה בזמן שהפלזמה מופעלת. תלבש חלוק מעבדה ומשקפי מגן חוסמי UV. משתמשים רק ב-99.999% הליום טהור; ודא אוורור מתאים. לאחר כל פעולת מוטגנזה, נגבו את שולחן העבודה ואת הקירות הפנימיים של תא המוטגנזה עם מטלית ללא סיבים טבולה באתנול של 75% (v/v). 75% אתנול הוא דליק מאוד. הימנע מהלהבות הפתוחות, ניצוצות ומשטחים חמים.

1. קבעו עקומה סטנדרטית המקשרת בין OD₆₀₀ לריכוז תאים תקין.
   1. החרינו מושבה אחת של B. coagulans לתוך מדיום זרעים ודגרו בטמפרטורה של 50°C, 200 סל"ד במשך 12 שעות עד שהתרבית מגיעה לשלב הלוגריתמי האמצעי.
   2. הכינו דילול סדרתי של תליית החיידקים במדרונות של 10⁴, 10⁵ ו-10⁶.
   3. פיפט 100 מיקרוליטר מכל דילול ומפזר באופן שווה על לוחות האגר הבינוני של הזרע בשלושה עותקים.
   4. דגרו את כל לוחות האגר המצופים בטמפרטורה של 50°C למשך 24 שעות.
   5. ספרו את יחידות יצירת המושבה (CFU) עבור כל דילול.
      הערה: הכיול מראה ש-OD₆₀₀ = 0.5 מתייחס לכ-1 ×^{10 8} CFU/mL. השתמש בקשר זה כדי לקבוע את צפיפות התאים ההתחלתית לכיסוי טיפות (איור משלים 3).
2. גידול B. coagulans לשלב הלוגריתמי האמצעי עד המאוחר, ואז מדלל את תרבית הזרעים הטרייה_{ל-OD 600} = 0.05 בתווך זרע טרי.
3. בתוך מכסה זרימה למינרי, יש להכין שמונה דיסקים מתכתיים קטנים סטריליים ודיסק מתכת גדול אחד. להבעיר את שמונת הדיסקים הקטנים על מבער אלכוהול למשך דקה, להניח אותם על הדיסק הגדול והסטרילי, ולתת להם להתקרר 10 דקות.
4. באמצעות מיקרופיפטה, פיזרו באופן אחיד 10 מיקרוליטר מהמתנשא החיידקי המדולל על כל אחד משמונה הדיסקים הקטנים המקוררים.
5. העבר את הדיסק הגדול הנושא את הדיסקים הקטנים המחוסנים לצלחת פטרי סטרילית.
6. הפעל את כלי ה-ARTP והפעיל את מסך הבקרה הראשי. הדליקו את מנורת ה-UV בתוך תא המוטגנזה. הפעל את המקרר וקירור מראש במשך 20 דקות עד שהטמפרטורה מתייצבת ב-20 מעלות צלזיוס.
7. פתח במהירות את דלת תא המוטגנזה והניח את הדיסקים הקטנים בפנים.
8. באמצעות מלקחיים סטריליים, העבר כל דיסק קטן ברצף לשלב הדגימה של ה-ARTP.
   הערה: הספק ה-RF, קצב זרימת גז הליום, מרחק הדיה לדגימה וטוהר ההליום היו קבועים ב-120 וואט, 10 SLM, 2 מ"מ ו-99.999%, בהתאמה. זמן קרינת ההליום נקבע ל-5, 10, 15, 20, 25 ו-30 שניות, בהתאמה.
9. יש לחשוף כל דיסק קטן למוטגנזה של ARTP בהתאם לפרמטרים הקבועים. לאחר ההקרנה, העבר את כל הדיסקים לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל חומר התאוששות. דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד במשך 4 שעות כדי לאפשר התאוששות וצמיחה של התאים.
10. קביעת שיעור הקטלניות.
    1. מדלל סדרתי את התרבית שנתפסה לגרדיאנט של ^10-2 עד ^10-6.
    2. פזרו 100 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר בינוניים של זרעים, והכינו שלושה שכפולים לכל דילול.
    3. דגרו את כל הלוחות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    4. ספרו את המושבות וחשבו את ה-CFU/mL המתאים.
    5. חשב את שיעור הקטלניות באמצעות הנוסחה:
       (1)
       הערה: בצע את הניסוי בשלושה עותקים לכל נקודת זמן. זמן המוטגנזה האופטימלי ל-ARTP במקרה זה הוא 20 שניות (איור משלים 4).

3. הרכב פלטפורמת המיקרופלואידיקה האוטומטית של טיפות ומוצרי צריכה

1. מערכת הפעלה (איור 1)
   הערה: הוא מורכב מ-3 ערוצים של בקרי לחץ מדויקים עם טווח לחץ של 0–1000 mbar וזמן תגובה של < 50 מילישניות (איור 1A).
2. מערכת הדמיה
   הערה: הדמיה מיקרוסקופית מהירה של CMOS כוללת קליטת נתוני תמונה במהירות גבוהה של ≥ 2 GB לשנייה, קצב פריימים של 0–20,000 fps, ורזולוציה מרבית של 1280 x 860. המערכת כוללת פוקוס אוטומטי לצפייה בזמן אמת בתנועת טיפות ותומכת בהקלטת תמונות וסרטונים, שניתן לייצא בפורמטים שונים, כולל BMP, AVI, MP4 ו-TIF.
3. מערכת גילוי
   הערה: הוא מאפשר זיהוי אות פלואורסצנטי באמצעות 2 לייזרים: 488 ננומטר ו-633 ננומטר, ו-2 ערוצי זיהוי.
4. מערכת בקרת מארח
   הערה: המערכת נשלטת על ידי תוכנת פלטפורמת מיקרופלואידיק טיפות אוטומטית, ומשלבת מודולים מרובים, כולל הפעלת נוזלים, הדמיה מיקרוסקופית, עירוי וזיהוי, יצירת טיפות, הזרקת פיקו ומיון. היא גם תומכת ברכישה, הקלטה, אחסון, תצוגה וייצוא של נתונים ניסיוניים. יחידות הפעלה חלקיות של פלטפורמת המיקרופלואיד האוטומטית של טיפות מוצגות (איור 1B).
5. מוצרי צריכה
   הערה: החומרים המתכלים המשמשים בפרוטוקול זה כוללים: צינור הזרקה לשלב שמן, דגימה ומגיב (איור 2A); צינור איסוף לדגירת טיפות (איור 2B); שבב יצירת טיפות (איור 2C); שבב פיקו-הזרקת טיפות (איור 2D); ושבב מיון טיפות (איור 2E).

4. יצירת טיפות

זהירות: נקה את פלטפורמת המיקרופלואיד האוטומטית של טיפות. לאחר כל ניסוי, נגבו את הבמה, מחזיק השבבים וכל אזור שפיכה ב-75% אתנול באמצעות מגבונים ללא סיבים. הסר שמן פלואורי שארי, מתלה תאים או תמיסת חיישנים.

1. כיסוי תא יחיד. כדי לקבל λ = 0.1 בטיפות של 14 pL, מדלל את השעון החיידקי_{ל-OD 600} ≈ 0.04 (OD₆₀₀=0.5 מתאים ל-1 ×^{10 8} CFU/mL). לפי התפלגות פואסון:
   (2)
   כאשר λ = 0.1, 90.5% מהטיפות ריקות, 9.1% מכילות תא יחיד, ו-0.4% מכילות מספר תאים.
   הערה: במקרה זה, היעילות שנמדדה לכיסוי תא יחיד הייתה 11.2% (איור משלים 5). מספר התאים לטיפה ניתן לקבוע באמצעות צביעת DAPI. כאשר λ = 0.1 וקצב הכיסוי הרב-תאי עולה על 1%, יש להפחית את ה-OD₆₀₀ כדי להוריד את אחוז הטיפות המכילות מספר תאים.
2. פיפטה 300 מיקרוליטר שמן פלואור לתוך בקבוק כניסת שלב השמן. פיפט 500 מיקרוליטר של ההשעיה החיידית אל תוך בקבוקון הכניסה של הפאזה המימית.
3. לקלף את הסרט שמכסה את פני השבב של יצירת הטיפות. חבר את בקבוק השמן, בקבוק הדגימה ובקבוק האיסוף לבארות המתאימות של השבב ברצף.
4. הנח את השבב על הבמה ואבטח אותו. חבר את צינורות האוויר לבקבוקי הכניסה אחד אחד לפי תוויות נתיב הגז.
5. פתח את תוכנת פלטפורמת המיקרופלואידיק האוטומטית של טיפות. כוון את כפתור תנועת הבמה לפי כיווני החצים על השבב כדי להזיז את שדה הראייה לאתר יצירת הטיפות.
6. לחץ על "התחל" בממשק "יצירת טיפות" של תוכנת פלטפורמת המיקרופלואידיק האוטומטית של טיפות (איור 3A). בממשק ההדמיה, גרור את "ציר ה-Z" ואת מחווני בהירות מקור האור כדי לכוון את בהירות ובהירות התמונה.
7. לחצו על כפתורי "+" ו-"-" של "מהירות טיפה" ו"גודל טיפה" כדי להתאים את מהירות הייצור וגודל הטיפה.
   הערה: במקרה זה, לחץ פאזה-שמן ולחץ פאזה הדגימה ליצירת טיפות מוגדרים אוטומטית ל-300 מ"בר ו-400 מ"בר, בהתאמה, כדי להשיג קצב ייצור של 1500 הרץ. בהגדרות אלו, נפח הטיפות הוא 14 pL, כאשר קוטר הטיפה נשמר מתחת ל-5%, מה שמבטיח גודל טיפה עקבי ותפעול אמין במורד הזרם.
8. חכה דקה עד שהציוד מתייצב ומצב יצירת הטיפות נשאר קבוע. החלף במהירות את בקבוקון האיסוף כדי להתחיל לאסוף טיפות.
   הערה: הוסיפו מראש כמות קטנה של שמן פלואור לצינור האיסוף החדש כדי לכסות את הפתח התחתון של צינור הטפלון, כדי להבטיח שהטיפות לא ייגעו ישירות בדופן הצינור ויגרמו לאיחוך.
9. הפסק את איסוף הטיפות לאחר 30 דקות של הפעלה. לחץ על "עצור" בחלון הקופץ כדי לאשר עצירת יצירת טיפות.
10. הסר בעדינות את צינור האיסוף מהשבב. הנח את הצינור ובקבוקון האיסוף אנכית וחכה שהטיפות בצינור ייכנסו לבקבוקון.
11. הסר את השבב, בקבוקון כניסת פאזה של השמן, ובקבוקון כניסת פאזה מימי מהשלב. נגב את משטח הבמה עם 75% אלכוהול. שלב יצירת הטיפות מושלם לאחר מכן.

5. גידול טיפות

1. הוסף 1 מ"ל שמן מינרלי לצינור האיסוף.
   הערה: שכבת השמן המינרלי מכסה את תליית הטיפות כדי למזער אידוי ולהפחית חשיפה לחמצן, תוך שמירה על החלפת גזים מספקת ל-B . coagulans האנאירובי הפקולטיבי.
2. הניחו את צינור האיסוף זקוף בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל מים סטריליים. שמור על צינור האיסוף עם כיסוי רפוי ודוגר בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך 10 שעות.
   הערה: לאחר הדגירה, יש לוודא שקוטר הטיפה הוא <10% ושאין התלכדות של טיפות. השליכו קבוצות אם הקריטריונים הללו אינם מתקיימים.

6. הזרקת פיקו בטיפות

זהירות: מתח גבוה מוחל על אלקטרודות השבב דרך חיבור המכשיר במהלך הזרקת פיקו. השדה החשמלי עלול לגרום לזעזוע חשמלי חמור. אל תיגע באלקטרודות או במשטח השבב עם כלים מתכתיים או בידיים חשופות בזמן שהמתח הגבוה פעיל. תמיד כבה את יציאת המתח הגבוה לפני הטיפול בשבב. לבשו כפפות מבודדות והשתמשו בכלים לא מוליכים.

1. הכין את בקבוקון כניסת שלב השמן. במכסה הזרימה הלמינרי, יש פיפטה של 300 מיקרוליטר שמן פלואורי אל בקבוק כניסת פאזה של השמן.
2. הכין את בקבוקון הכניסה לדוגמה. הסר את פקק הבקבוקון מהצינור שמכיל את הטיפות. תחליף אותו במכסה חדש.
3. גזם את קצה הבקבוקון החדש של הפתח. חתוך חלק קטן מהקצה הקדמי של בקבוקון הכניסה החדש כך שהקצה יגיע מתחת לרמת הנוזל של הטיפות בבקבוק הדגימה.
4. הדק את המכסה. אבטח את המכסה היטב כדי למנוע דליפה.
5. הכינו את בקבוקון כניסת המגנט. פיפט 500 מיקרוליטר של חיישן חומצת הלקט לתוך בקבוק כניסת התגובה.
6. הוסף PBS לבקבוק כניסת הריאגנט. במקביל, הוסיפו 500 מיקרוליטר של בופר PBS סטרילי לאותו בקבוק כניסת ריאגנט.
   הערה: בופר PBS נוסף בניסוי זה כדי לאזן את ה-pH של הטיפות. ריכוז העבודה הסופי של חיישן הלקטט היה 0.1 מ"ג/מ"ל, ונפח העומס של חיישן הלקטט היה 500 מיקרוליטר.
7. השתמש בלהב כדי לחתוך את הסרט שמכסה את בארות האלקטרודות כדי לחשוף את האלקטרודות. הגדר את המולטימטר למצב רציפות ובדוק את חיבור המעגל ואת מצב הקצר של השבב.
   הערה: אם המולטימטר מראה חיבור תקין של אלקטרודות השבב, המשך לשלב הבא. אם המעגל פתוח, החלף את שבב ההזרקה ובדוק שוב.
8. לאחר אישור חיבור תקין של המעגל עם המולטימטר, הסר את הסרט ממשטח השבב. חבר את בקבוק השמן, בקבוק הדגימה, בקבוק התגובה ובקבוקון האיסוף לבארות המתאימות של השבב ברצף.
9. הנח את השבב על הבמה ואבטח אותו. חבר את צינורות האוויר לבקבוקי הכניסה אחד אחד לפי תוויות נתיב הגז.
10. פתח את תוכנת פלטפורמת המיקרופלואידיק האוטומטית של טיפות. כוון את כפתור תנועת הבמה לפי כיווני החץ על השבב כדי להזיז את שדה הראייה לאזור האלקטרודה של שבב הטיפה.
11. לחץ על "התחל" בממשק "Droplet Pico-injection" של תוכנת פלטפורמת המיקרופלואידיק האוטומטית של טיפות (איור 3B). בממשק ההדמיה, גרור את "ציר ה-Z" ואת מחווני בהירות מקור האור כדי לכוון את בהירות ובהירות התמונה.
    הערה: בשלב זה, המכשיר מכוון אוטומטית את לחץ משאבת פאזה של שמן ל-400 מ"בר, לחץ משאבת פאזה לדגימה ל-420 מ"בר, ואת לחץ משאבת ההזרקה-פאזה ל-450 מ"בר.
12. בשלב הראשוני של הפעולה, קטע אוויר מהקטטר משתחרר לתוך השבב, תופעה רגילה שנמשכת מספר דקות.
13. חכה לטיפות שייכנסו לשדה הראייה. לחץ על "Start Pico-injection". בשלב זה, השדה החשמלי של הציוד יופעל. כוונן את מהירות יצירת הטיפות, מרווח הטיפות ונפח ההזרקה על ידי לחיצה על כפתורי "+" ו"-" של "מהירות טיפות", "מרווח טיפות" ו"עוצמת הזרקה".
    הערה: השדה החשמלי מוגדר להילוך המקסימלי ברירת המחדל. אם טיפות נשברות באזור השדה החשמלי במהלך תהליך ההיתוך, עברו להילוך בינוני או נמוך. במקרה הזה, קצב הזרקת הטיפות היה 200 הרץ.
14. התבונן בתוכנת תצוגת תמונות מהירה. אם הטיפות יכולות להזריק באופן יציב לחיישן החומצה הלקטית ביחס של 1:1, חכו 5 דקות עד שהציוד יתייצב. החלף במהירות את בקבוקון האיסוף כדי להתחיל לאסוף טיפות.
15. לאחר הזרקה יציבה למשך שעתיים, לחץ על "עצור" כדי לסיים את הזרקת הפיקו של הטיפות.
16. הסר בעדינות את צינור האיסוף מהשבב. הנח את הצינור ובקבוקון האיסוף אנכית וחכה שהטיפות בצינור ייכנסו לבקבוקון.

7. מיון טיפות

זהירות: הדמולסיפייר הוא מגרה ועלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. הוא גם מזיק אם נשאף או נבלע. תמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה, משקפי מגן). לטפל במפילה באזור מאוורר היטב או במכסה אדים. אספו את דמולסיפייר הפסולת במיכל נפרד עם תווית ברורה. אל תשפוך את הכיור.

1. במכסה הזרימה הלמינרי, יש לפזר פיפטה של 300 מיקרו ליטר של שמן פלואור ולהוסיף אותו לבקבוק כניסת פאזה של השמן. החלף את מכסה הבקבוקון של צינור האיסוף המכיל טיפות מוזרקות במכסה חדש.
   הערה: לפני ביצוע ניסויי מיון טיפות, קחו 5 מיקרוליטר של טיפות וצפו בהן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. למדוד את קוטר לפחות 200 טיפות; המשך רק אם קורות החיים < 10%.
2. השתמש בלהב כדי לחתוך את הסרט שמכסה את בארות האלקטרודות כדי לחשוף את האלקטרודות. הגדר את המולטימטר למצב רציפות ובדוק את חיבור המעגל ואת מצב הקצר של השבב.
3. לאחר אישור חיבור תקין של המעגל עם המולטימטר, הסר את הסרט ממשטח השבב. חבר את בקבוק השמן, בקבוקון הדגימה ובקבוק איסוף המיון לבארות המתאימות של השבב ברצף.
4. הנח את השבב על הבמה ואבטח אותו. חבר את צינורות האוויר לבקבוקי הכניסה אחד אחד לפי תוויות נתיב הגז.
5. פתח את תוכנת ההדמיה המהירה. כוון את כפתור תנועת הבמה לפי כיווני החץ על השבב כדי להזיז את שדה הראייה לאזור האלקטרודה של שבב הטיפה.
6. לחץ על "התחל" בממשק "מיון טיפות" של תוכנת פלטפורמת המיקרופלואידיק האוטומטית של הטיפות. בממשק ההדמיה, גרור את "ציר ה-Z" ואת מחווני בהירות מקור האור כדי לכוון את בהירות ובהירות התמונה.
   הערה: לאחר לחיצה על "התחל", המכשיר מכוון אוטומטית את לחץ משאבת השמן ל-300 מ"בר ואת לחץ משאבת הדגימה ל-190 מ"בר, מה שמוביל לקצב העברת טיפה של 100 הרץ.
7. בשלב הראשוני של הפעולה, קטע אוויר מהקטטר יופרק אל השבב, דבר שיימשך מספר דקות והוא תופעה רגילה.
8. לחץ כדי לבחור את "לייזר" ובחר את ערוץ הזיהוי של 488 ננומטר.
   הערה: אנשי הניסוי עשויים לבחור לייזר 488 ננומטר, לייזר 633 ננומטר, או שילוב של שניהם, בהתאם לעיצוב הגילוי הניסיוני. הספק לייזר: 20 מיליוואט.
9. לחץ על "הקלטת נתונים". המכשיר יתחיל לקלוט אותות פלואורסצנציה של טיפות (איור 3C).
   הערה: איסוף אותות פלואורסצנציה מ-50,000 עד 100,000 טיפות; המכשיר ימיין אוטומטית את ערכי האות ויפיק היסטוגרמה של אות פלואורסצנטי.
10. בהתבסס על ההיסטוגרמה של אות הפלואורסצנציה שנוצרה, קבע את סף המיון ל-0.1% העליון של אותות הפלואורסצנציה הכוללים, ואסוף טיפות עם ערכי אות פלואורסצנציה מעל סף זה.
    הערה: במקרה זה, שער המיון הוגדר לאסוף טיפות בעוצמת פלואורסצנציה > 2750 (a.u.), מה שמקביל ל-0.1% העליון של הטיפות.
11. לחץ שוב על "הקלטת נתונים". המכשיר יקליט מחדש את אותות הפלואורסצנציה מהטיפות הנותרות וימיין את טיפות המטרה לפי הסף שנקבע בסעיף 7.10.
    הערה: אותות הטיפה שנותרו גם הם ימוינו ויוצגו אוטומטית כהיסטוגרמה פלואורסצנטית.
12. לאחר בחירת אזור הטיפה המטרה, הפעל את "מתג המיון" והגדר את ערך "כוח ההסטה". הציוד יתחיל למיין טיפות.
    הערה: המכשיר מספק שלוש רמות עוצמת שדה חשמלי לבחירה (גבוה, בינוני, נמוך). לטיפות גדולות מ-30 מיקרון, בחרו בגבוה; לטיפות שהן קטנות מ-25 מיקרון, יש לבחור בינוני או נמוך. זה מבטיח סטייה יציבה ויעילות מיון מיטבית.
13. לאחר שהציוד מתייצב ל-5 דקות, החלף את בקבוקון האיסוף כדי לאסוף טיפות חיוביות.
    הערה: במהלך המיון, המכשיר מודד ברציפות את עוצמת הפלואורסצנציה של כל טיפה בזמן אמת ומשווה אותה לסף שנקבע מראש. רק טיפות בעוצמת פלואורסצנציה מעל הסף מוסטות ונאספות לצינור האיסוף החיובי. טיפה נחשבת חיובית אם המכשיר מציג אות פלואורסצנציה העולה על סף המיון, ובמקביל נצפית סטיית טיפות בממשק ההדמיה, מה שמאשר שהטיפה הופנתה בהצלחה לערוץ האיסוף החיובי.
14. הפסק את מיון הטיפות אחרי 4 שעות של פעולה יציבה. לחץ על "עצור" בממשק "מיון טיפות".
15. הסר בעדינות את צינור האיסוף מהשבב. הניחו את הצינור ובקבוקון האיסוף אנכית כדי להבטיח שהטיפות בצינור ייכנסו לבקבוקון.
16. לאחר השלמת איסוף הטיפות, לחצו על גרף הפיזור כדי לשמור את גרף הפיזור של הניסוי, ערכי אות הפלואורסצנציה של הטיפות החיוביות הממוינות וערכי אות הפלואורסצנציה של כל הטיפות.
17. הסר את השבב, בקבוק כניסת שלב השמן, בקבוקון הדגימה ובקבוקון התגובה מהשלב. סגור את התוכנה.
18. דמולסיפיקציה של טיפות. הוסף 500 מיקרוליטר של 1H, 1H, 2H, 2H-פרפלואורוקטנול לצינור איסוף הטיפות. המתינו 5 דקות, ואז מוסיפים 500 מיקרול מדיום סינון טרי להחלמה.
    הערה: אין לנער את צינור האיסוף בעוצמה לאחר הוספת הדאמולסיפייפר; ערבב בעדינות. לאחר דמולסיפיקציה של הטיפות, ייווצר ממשק ברור בין השלב המימי לשמן.
19. קח 20 מיקרול מהמתלה החיידקית הדמולסיבית, מדלל אותו פי 10, ומרח אותו על שני לוחות אגר. דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    הערה: גורם הדילול יכול להיות מותאם בהתאם למספר הטיפות שנאספו. במקרה זה, הושגו כ-400 מושבות בודדות משני הלוחות.

8. ייצוא נתונים

1. לחצו על גרף אות הפלואורסצנציה באזור הריק של ממשק מיון התוכנה. בחרו לשמור את תרשים פיזור אות הפלואורסצנציה של הטיפות, את ההיסטוגרמה של אות הפלואורסצנציה, ואת גיליון אקסל של אות הפלואורסצנציה, המכילים את ערכי עוצמת הפלואורסצנציה של מספר הטיפות הכולל, וכן את ערכי עוצמת הפלואורסצנציה של הטיפות החיוביות שנסקרו.

9. סקר מיקרופלט ראשוני

1. בחר מושבות בודדות באקראי.
2. החסן את לוח הבאר העמוק של 24 בארות לתרבות התרחבות. בחרו כל מושבה נבחרת והחרינו אותה לבאר אחת מתוך צלחת באר עמוקה בת 24 בארות המכילה 2 מ"ל מדיום תסיסה. השתמש בלולאת חיסון.
3. אטום את פלטת הבאר העמוקה של 24 בארים עם ממברנה שאינה נושמת.
   הערה: אין להשתמש בממברנה נושמת. הוא גורם לאידוי של מדיום התרבות.
4. לטפח את תרבות ההתרחבות. הניחו את לוח הבאר האטום עם 24 בארות עמוק בתנור ניעור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד למשך 24 שעות.
5. תת-תרבות לאימות תסיסה. לאחר 24 שעות, העבירו 200 מיקרוליטר תרבית מכל באר לפלטת קידוח עמוקה טרייה בת 24 בארות המכילה 1.8 מ"ל חומר תסיסה (10% v/v). הוסיפו CaCO₃ סטרילי לריכוז סופי של 4% (w/v) לכל ריכוז הרבה לפני החיסון כדי לאזן את ה-pH.
6. כלול בקרות. בכל לוח חדש של 24 בארות עמוק, מלא שלושה בארות שנבחרו באקראי בזן ההורי ATCC 7050 כביקורת שלילית. עבד אותם באותה צורה כמו הזנים המועמדים.
7. אטום את פלטת הבאר העמוקה של 24 בארים עם ממברנה שאינה נושמת.
8. דגרו את צלחת הבאר העמוקה של 24 הבארות. הנח את הפלטה האטומה באינקובטור ניעור בטמפרטורה של 50°C, 200 סל"ד למשך 24 שעות.
9. הכינו דגימות לגילוי לקטטים. צנטריפוגה את הפלטה ב-5,842 × גרם למשך 10 דקות. העבר 10 מיקרוליטר מהסופרנטנט למיקרופלטה שחורה בעלת 96 בארות ומדלל ב-990 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים. ערבב טוב.
10. הוסף את חיישן הלקטט. הוסיפו 100 מיקרולטר מהדגימה המדוללת לכל באר של צלחת שחורה טרייה עם 96 בארות. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מחיישן חומצת הלקטית. ערבב בעדינות.
11. מדדו פלואורסצנציה. דגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות (מוגן מאור). מדדו פלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלט עם עירור ב-485 ננומטר ופליטה ב-515 ננומטר.
12. הגדר את סף בחירת הפגיעה. חשב את הפלואורסצנציה הממוצעת של שלושת בארות הבקרה ההורית (הורה) וסטיית התקן (SD_parent). הגדר את הסף כ-F_parent + 3 × SD_parent.
13. זהה פגיעות ראשוניות. מתח מועמד נחשב לפגיעה ראשונית אם אות הפלואורסצנציה שלו עולה על הסף. רשמו את מספר הפגיעות הראשוניות לאימות במורד הזרם.

10. אימות משני של זנים בעלי תפוקה גבוהה

זהירות: השלב הנייד מכיל חומצה גופרתית מדוללת (5 מ"מ), שהיא קורוזיבית. הימנעו ממגע עור ושאיפה. לבש ציוד מגן אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה, משקפי מגן). הכינו וטפלו בשלב הנייד באזור מאוורר היטב או במכסה אדים. אסוף את כל הפסולת המכילה חומצה במיכל ייעודי לפסולת חומצה לצורך הטמנה נכונה. אל תשפוך את הכיור.

1. הכינו את תרבית הזרעים. השפך את הזנים העיקריים על לוחות האגר הבינוני של הזרע. דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. בחר מושבה אחת מכל צלחת והחריך אותה לתוך 30 מ"ל מדיום זרעים נוזלי בבקבוק שייק-בקבוק של 250 מ"ל. דגרו ב-50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד למשך 12 שעות.
2. הכינו את התסיסה. הכינו את מדיום התסיסה והוסיפו אבקת CaCO3 סטרילית לריכוז סופי של 4% (ללא וייט) כנטרל pH. העבר 5 מ"ל מתרבות הזרעים ל-45 מ"ל של מדיום זה בבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מ"ל (10% v/v; נפח עבודה סופי 50 מ"ל).
   הערה: השתמש בשלושה בקבוקים עצמאיים לכל זן מועמד ולזן ההורי ATCC 7050 כבקרה.
3. דגר את הבקבוקים. הנח את הבקבוקים באינקובטור ניעור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד. תסיסה במשך 24 שעות.
4. לאסוף דגימות. אחרי 24 שעות, קח 1 מ״ל תרבית מכל בקבוק. צנטריפוגה ב-13,800 × גרם למשך 2 דקות. מדלל את הסופרנטנט פי 100 במים אולטרה-טהורים וסינן דרך פילטר מזרק של 0.22 מיקרון.
5. הגדר תנאי HPLC. השתמש בעמודת Aminex HPX-87H. הכינו פאזה ניידת: 5 mM H₂SO₄ במים אולטרה-טהורים, סיננו דרך ממברנה של 0.22 מיקרון, ודהרו גזים באמצעות סוניקציה. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-40 מעלות צלזיוס, קצב זרימה ל-0.6 מ"ל לדקה, נפח הזרקה ל-20 מיקרוליטר, וזמן הרצה ל-20 דקות לכל דגימה (חומצה לקטית נפלטת ב~12.600 דקות). השתמש בגלאי מקדם שבירה (RID).
6. הכן את העקומה הסטנדרטית. המיס סידן L-לקטט במים אולטרה-טהורים להכנת תמיסות סטנדרטיות של 0, 0.4, 0.8, 1.2 ו-1.6 גרם לליטר (המובע כסידן L-לקטט). הזריק כל תקן בשלוש עותקים.
   הערה: השווה את שטח השיא מול הריכוז וקבל את משוואת הרגרסיה הליניארית (R² > 0.999). הרץ תקנים בתחילת ובסוף כל מחזור דגימה כדי לתקן דריפט.
7. הזריק את הדגימות. הזרקו את הסופרנטנטים של התסיסה המסוננים (20 מיקרוליטר) למערכת ה-HPLC. רשמו את אזור השיא של שיא הסידן L-לקטט.
   הערה: הזרקו דגימת בקרת איכות (1 גרם לליטר L-לקטט סידן) כל 10 דגימות כדי לעקוב אחר יציבות המערכת. הזזת זמן השמירה המקובלת היא <0.2 דקות ושינויי שיא באזור <5% בהשוואה לתקן הכיול הראשוני.
8. חשב את תפוקת חומצת L-לקטית. אינטרפולציה של שטח השיא של כל דגימה לעקומה הסטנדרטית כדי לקבל את ריכוז הסידן L-לקטט (g/L).
   הערה: המרו לריכוז חומצה L-לקטית באמצעות יחס המשקל המולקולרי:
   (3)
   חשב את אחוז השיפור:
   (4)
9. זהה את הזנים הסופיים בעלי תפוקה גבוהה. בחרו את הזנים שמראים באופן עקבי תפוקה גבוהה יותר של חומצה L-לקטית מאשר הזן ההורי כמוטנטים מאומתים. בחר את השחקן הטוב ביותר להמשך דמויות.

11. הערכת יציבות גנטית של זנים בעלי תפוקה גבוהה

1. פזר את הזן המוטנטי שנבחר על פלטות אגר בינוני של זרעים. דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. זה דור 1.
2. בחר מושבה אחת מהצלחת דור 1 והחריך אותה ב-5 מ"ל של מדיום זרעים נוזלי בצינור של 50 מ"ל. דגרו ב-50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 12 שעות כדי לקבל את תרבית הזרעים F1.
3. העבר 10% (v/v) מתרבות הזרעים מדור 1 ל-50 מ"ל של מדיום תסיסה (המכיל 4% עם CaCO₃ סטרילי) בבקבוק שייק-בקבוק של 250 מ"ל. דגרו ב-50 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד ל-24 שעות.
4. אסוף 1 מ"ל תרבית לאחר התסיסה. צנטריפוגה ב-13,800 × גרם למשך 2 דקות, מדללים את הסופרנטנט פי 100 במים אולטרה-טהורים, ומדדו את ריכוז חומצת L-לקטית באמצעות HPLC. השתמש בשלושה בקבוקים עצמאיים לכל דור.
5. כדי להשיג את הדור הבא, יש להניח לולאה של תרבית דור 1 על צלחת אגר בינוני עם זרעים טריים. דגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. חזור על שלבים 11.2 ו-11.3 לדור השני.
6. חזור על תהליך התת-תרבות כדי לקבל דור 3 ודור 4. לכל דור, הכן שלושה שייק-פלאסקס ומדד את ייצור חומצת החלב על ידי HPLC.
7. השוו את התשואות של ארבעת הדורות (1–4) באמצעות ANOVA חד-כיווני או מבחן t של סטודנט. הזן נחשב ליציב גנטית אם לא נצפה הבדל משמעותי (p > 0.05) בייצור חומצת החלב בין דורות.

תוצאות

בהתבסס על פלטפורמת המיקרופלואידיקה האוטומטית של טיפות, הוקם מודל סינון בתפוקה גבוהה. ספריית מוטנטים של B. coagulans נבנתה על ידי מוטגנזה ARTP עם זמן הקרנה אופטימלי של 20 שניות, שהעניק שיעור קטלניות של כ-90% (איור 4A). התאים המוטנטיים נעטפו לאחר מכן בטיפות של 14 pL, בקוטר של כ-30 מיקרון, בקצב ייצור של 1500 הרץ (איור 4B). לאחר דגירה ב-45 מעלות צלזיוס למשך 10 שעות, החיישן הוזרק פיקו לכל טיפה בקצב של 200 הרץ (איור 4C). ...

דיון

פרוטוקול זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי לסינון מיקרוביאלי תעשייתי המבוסס על פלטפורמת מיקרופלואידיק טיפות אוטומטית. תהליך העבודה המשולב כולל בניית ספריות מוטנטים, יצירת טיפות וכיסוי תא יחיד, טיפוח מיקרו-כור, הזרקת חיישנים ביולוגיים, מיון טיפות מופעלות על ידי פלואורסצנציה, ואימות סופי של זני המטרה. באמצעות סינון בתפוקה גבוהה של B. coagulans המייצר חומצה L-לקטית בתפוקה גבוהה כמקרה אימות, זרימת עבודה זו הדגימה יתרונות רבים על פני שיטות מיקרופלט ואגר-פלטות קונבנציונליות בהקשר לשיפור הזן...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	Becton, Dickinson and Company	214030	לצורך הכנת צלחות מוצקות
אתנול נטול מים	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	לניקוי וחיטוי שולחנות ומכשירים במעבדה
פלזמה אטמוספרית וטמפרטורת חדר (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  שימש לבניית ספריית המוטציות למוטגנזה של זנים.
B. coagulans	מרכז האוסף לתרביות מיקרוביאליות בבייג'ינג, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 שימש כזן המוצא למוטגנזה והמטרה למיון טיפות בתפוקה גבוהה.
מיקרופלטה שחורה (96 באר)	Corning	3925	המיקרופלטה השחורה בת 96 הבאר שימשה למבחני חיישן לקטט ולקביעת ריכוז החומצה הלקטית.
סידן פחמתי	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	כדי לבודד מפיקי לקטט L-לקטיים יתר על המידה.
סידן כלורי	Sinopharm	10005819	סידן כלורי משמש להכנת מדיום תרבית מיקרוביאלי, המספק חומרים תזונתיים חיוניים לגידול מיקרוביאלי.
סידן L-לקטט	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	משמש כדגימות להכנת עקומת תקן בתהליך הגילוי.
צינור צנטריפוגה (15 מ"ל)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	משמש לדילול נוזל חיידקים
צינור איסוף	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	לאסוף טיפות וטיפוח עוקב
מחשב	Lenovo	E450	התקנת תוכנה ובקרת DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	לצביעת תאים.
פלטה עמוקה (24 באר)	BKMAMLAB	110424008	לאישור תשואה ראשוני של מוטציות B. coagulans באמצעות פלטות עמוקות
מפרק טיפות (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	מפרק הטיפות משמש לפירוק מיקרו-טיפות מים בשמן ולשחרור התאים, הזנים או העל-תשתית הפנימיים לגילוי וניתוח עוקבים.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose משמש להכנת מדיום תרבית מיקרוביאלי, המספק חומרים תזונתיים חיוניים לגידול מיקרוביאלי.
דיאמוניום מימן ציטראט	Solarbio	D9950	דיאמוניום מימן ציטראט משמש להכנת מדיום תרבית מיקרוביאלי, המספק חומרים תזונתיים חיוניים לגידול מיקרוביאלי.
דיפוטסיום מימן פוספט נטול מים	Sigma-Aldrich	P8281	דיפוטסיום מימן פוספט נטול מים משמש להכנת מדיום תרבית מיקרוביאלי, המספק חומרים תזונתיים חיוניים לגידול מיקרוביאלי.
גרסת תוכנת DREM	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	לבקרת מכשיר DREM Cell. תוכנת DREM היא תוכנית מסחרית קניינית בלעדית עבור מכשיר DREM Cell מבית Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. אין לה גישה רשמית ציבורית או URL להורדה והיא מופצת אך ורק עם המכשיר באישור.
מיין תאים מיקרופלואידי בעל לכידת טיפות (תא DREM)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	שימש לכידה מיידית של תאים יחידים ולמיון כדי לסנן במהירות זנים מייצרים גבוהים מספריית המוטציות.
שבב יצירת טיפות	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	שבב יצירת הטיפות משמש להפקת טיפות מונודיספרסיות בסדר הגודל של פיקוליטר (pL) לצורך כליאת תאים יחידים.
שבב הזרקת טיפות	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	שבב המיקרו-הזרקת הטיפות משמש להשגת הזרקה מדויקת ומדויקת של ריאגנטים לטיפות שהוכנו מראש לצורך תגובות ביוכימיות עוקבות.
שבב מיון טיפות	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	שבב מיון הטיפות משמש למיון טיפות יעד המכילות תאים מייצרים גבוהים על בסיס אותות פלואורסצנטיים.
בקבוק תרבות מתנדנד Erlenmeyer (250 מ"ל)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	משמש לאימות תרבות בקנה מידה מוגדל של מוטציות של חיידקי B. coagulans לאחר סינון ראשוני עם פלטות עמוקות, כדי לאשר את היציבות והשחזור של זנים מ