מאמר שיטה

פרוטוקול אופטימלי לטרנספקציה הפוכה להחדרת mRNA של טלומראז למפיבלובלסטים אנושיים בשלבי סנסקנס מוקדמים

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 באוגוסט 2026

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לטרנספקציה הפוכה למסירה יעילה של mRNA של טלומראז רברס טרנסקריפטאז אנושי (hTERT mRNA) בעל מודיפיקציית נוקליאוזיד, אל תוך פיברובלסטים אנושיים מזדקנים (senescent). ציפוי מוקדם של משטחי התרבית בקומפלקסים של hTERT mRNA-ליפיד משפר את הספיגה, ומאפשר הפעלת טלומראז, הארכת טלומרים והשבה חלקית של נעורי התאים. בסופו של דבר, התרביות חוזרות למצב של זקנה תאית או משבר (crisis) ללא הגעה לאימורטליזציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזקנה התאית (Cellular senescence) קשורה לשינויים עמוקים בפיזיולוגיה התאית, הכוללים ירידה בנזילות הממברנה, פגיעה בתעתוק אנדוזומלי, ירידה ביכולת האנדוציטוזה ועלייה בפעילות RNase חוץ-תאית, אשר כולם מעכבים מסירה יעילה של mRNA. חסמים אלו הגבילו את היישום של גישות מבוססות RNA בתאים מזדקנים, ובמיוחד עבור מסירה של תמלילי טיפוליות גדולים. פרוטוקול זה מתאר שיטת טרנספקציה הפוכה (reverse-transfection) מותאמת למסירה יעילה של RNA שליח (mRNA) מושנה לתוך פיברובלסטים אנושיים מזדקנים. למרות ש-mRNA של human telomerase reverse transcriptase (hTERT) שימש כתמליל המודל, סבב העבודהו רחב וניתן להחלה על סוגי mRNA אחרים. בניגוד לשיטות טרנספקציה קונבנציונליות, שבהן קומפלקסים של RNA-ליפיד מתווספים למצע התרבית לאחר היצמדות התאים, טרנספקציה הפוכה מניחה את הקומפלקסים על פני השטח של התרבית לפני זריעת התאים, מה שמאפשר אינטראקציה ישירה בין התאים הנצמדים לבין קומפלקסי הטרנספקציה. כדי למקסם את יעילות הטרנספקציה, הפרוטוקול משלב mRNA עם מודיפיקציות של נוקלאוזידים המכילים pseudouridine ו-5-methylcytidine, זנבות poly(A) מוארכים, תזמון מותאם ליצירת הקומפלקס, עיכוב RNase, העלאה זמנית של ה-pH האנדוזומלי באמצעות chloroquine, הגדלה של צפיפות זריעת התאים ותקופות אינקובציה מוארכות. באמצעות גישה זו, הושגה יעילות טרנספקציה של כ-50%–80% בפיברובלסטים מזדקנים בעקבות מסירה של תמליל hTERT mRNA באורך 5 kb. שיא פעילות הטלומרז נצפה 24–48 h לאחר הטרנספקציה. מחזור טרנספקציה בודד הניב הארכה מדידה של הטלומרים, בעוד ששלוש טרנספקציות רצופות הובילו להארכה משמעותית אך מוגבלת של הטלומרים. היפוך חלקי של פנוטיפים הקשורים להזדקנה היה ניתן לזיהוי בתוך 72–96 h, כולל ירידה בפעילות β-galactosidase הקשורה להזדקנה, ירידה בביטוי של p16 ו-p21, שיקום המורפולוגיה התאית והארכה של ת गृह lifespan רפליקטיבי. ה-hTERT mRNA שנמסר התפרק בתוך 72–96 h, ולא נצפתה אלמוות (immortalization). פרוטוקול זה מספק גישה מעשית למסירה זמנית של mRNA לתוך תאים מזדקנים ועשוי להיות ניתן להתאמה למגוון רחב של סוגי תאים ומינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישת הטרנספקציה ההפוכה (reverse transfection) מהווה התאמה מתודולוגית קריטית עבור תאים מזדקנים (senescent cells), אשר מתגברת על המחסומים הבסיסיים שתאים אלו מציבים בפני שיטות טרנספקציה סטנדרטיות. בניגוד לטרנספקציה רגילה (forward transfection), שבה התאים נזרעים מראש ומורשים להיקשר לפני הוספת קומפלקסי הטרנספקציה, טרנספקציה הפוכה כוללת הוספה של תאים בתליה ישירות על קומפלקסי mRNA-ליפיד של hTERT שהוכנו מראש. טכניקה זו מגבירה באופן דרמטי את יעילות הטרנספקציה בתאים מזדקנים על ידי מקסום החשיפה לקומפלקסי הטרנספקציה במהלך שלב ההיחבסות הקריטי, כאשר עיצוב הממברנה מחדש הוא בשיאו.

השינוי המושגי המרכזי בפרוטוקול הוא התייחסות לתאים מזדקנים (senescent cells) כאל בעיית הובלה ייחודית, ולא רק כגרסאות של תאים צעירים שקשה להעביר בהם טרנספקציה. בזקנה תאית, שינויים גלובליים בהרכב הליפידים של הממברנה, כולל פוספוליפידים, ספינגוליפידים וכולסטרול, משנים את נזילות הממברנה, את קימורה ואת האינטראקציות בין חלבונים לליפידים, ובמקביל תורמים לפנוטיפ הפרשתי הקשור לזקנה (SASP)1,2,3. תאים מזדקנים מראים גם הפחתה באנדוציטוזה של רצפטורים המתווכת על ידי קלתירין וקאוולאולין (caveolae) ושינוי בניתוב האנדוציטוטית, המונעים בחלקם על ידי דאון-רגולציה של amphiphysin-1 ושינויים פיצויים בביטוי של caveolin, אשר מעכבים את הספיגה והאות המתווכות על ידי רצפטורים4,5,6. במקביל, ציר האנדוזום המאוחר-ליזוזום המוסדר על ידי Rab7 והרשת האנדוזומלית-אוטופגית-ליזוזומלית (EAL) הרחבה יותר הופכות לבלתי מאוזנות, כאשר Rab7 פועל כבקר מרכזי של הבשלת האנדוליזוזום ושל היתוך אוטופגוזום-ליזוזום, תהליכים המופרעים בהזדקנות ובניוון עצבי7.

תאים מזדקנים (Senescent cells) נוטים להעלות את הביטוי של רכיבים מרובים במערכת העיבוד וההסתגלות הליזוזומלית (LYPAS), כולל ביוגנזה ליזוזומלית המונחית על ידי TFEB/TFE3 ואוטופגיה מתווכת-צ'פרון, ובכך הם מגדילים את המסה הליזוזומלית. עם זאת, ליזוזומים בודדים מראים לעיתים קרובות pH לומינלי גבוה, נזק לממברנה ויכולת פרוטאלולית משובשת, מה שתורם לתפקוד ליזוזומלי לקוי למרות השפע הגובר שלהם8,9,10,11. יחד, שינויים אלו עשויים לנתב חומרים שהופנמו ביעילות רבה יותר למסלולי פירוק אנדוליזוזומליים, ובכך להגדיל את הסבירות ש-RNA או חלבון שהגיעו לתא יפורקו לפני שיושפעו לשחרור ציטוזולי יעיל9,10,11. טרנספקציה הפוכה (Reverse transfection) מכוונת ישירות לחלון הזמן המוקדם ביותר שבו הממברנות עוברות עיצוב מחדש, במהלך ההיצמדות, ובכך היא כופה מגע מתמשך ובעל זיקה גבוהה בין התאים לבין קומפלקסים של mRNA-ליפידים, ובכך עוקפת, לפחות חלקית, אנדוציטוזה לקויה במצב יציב בתאים מזדקנים ההיצמדו באופן מלא4,5,6,12.

מבחינת תכנון ה-RNA, הפרוטוקול מניח כי בהקשר של הזדקנות, בסיס פשוט של cap + tail אינו מספיק: שינוי מלא של הנוקליאוזידים (לדוגמה, pseudouridine או N1‑methylpseudouridine בתוספת 5‑methylcytidine) נחשב למבצע הכרחי כדי לנתק את התרגום מהזיהוי על ידי קולטני Toll-like אנדוזומליים ומשרה של interferon מסוג I. עבודות יסוד הראו כי שילוב של נוקליאוזידים שעברו שינוי ב-RNA מדכא את הפעלת TLR3, TLR7 ו-TLR8 ומפחית באופן משמעותי את ייצור הציטוקינים בתאי דנדריטיים, מה שמספק בסיס מכניסטי לתגובתיות החיסונית המולדת המופחתת של פלטפורמות mRNA נוכחיות בעלות נוקליאוזידים שעברו שינוי13. סקירות עדכניות יותר של חיסוני mRNA–LNP ותרופות mRNA מדגישות הנדסה מתואמת של ה-5′ cap, ה-UTRs, הרצף המקודד וזנב ה-poly(A) כדי להגביר את היציבות והתרגום in vivo תוך מזעור הפעלת מערכת החיסון המולדת14. בפרט, אורך ומבנה זנב ה-poly(A) התגלו כגורמים מרכזיים ליציבות של mRNA המשוכתב in vitro ולתפוקת התרגום, מה שמוביל לתכנוני poly(A) מוארכים או מהונדסים ב-mRNA טיפולי15.

בנוסף לכך, הפרוטוקול כולל הגנה מפורשת מפני RNases חוץ-תאיים ואנדוזומליים במהלך היווצרות הקומפלקס והספיגה, יחד עם חלון בריחה אנדוזומלי מוגדר באמצעות סוכן ליסוזומוטרופי זמני כגון chloroquine16,17. Chloroquine משמש מזה זמן רב כגשש תפקודי של מחסומים אנדוזומליים ויכול להגביר באופן משמעותי את המעורבות עם המטרה ואת ההשתקה על ידי siRNA או אוליגנוקלאוטידים אנטיסנס, על ידי קידום הפרעה של ממברנה אנדוזומלית ובריחה של מטען חומצות הגרעין אל הציטוזול18. במקביל, דימיון של תאים חיים ודימיון ברזולוציה גבוהה (super-resolution) של mRNA המסומך על LNP הדגימו כי מסירה יעילה מוגבלת באופן חריף על ידי אירועי בריחה נדירים מאנדוזומים מוקדמים/ממחזרים, ולא על ידי הספיגה הראשונית כשלעצמה, מה שמדגיש את החשיבות של הנדסה מכוונת של שלב הבריחה האנדוזומלית עבור תרפיה מבוססת mRNA19.

בסך הכל, שינויים אלו הקשורים להזדקנות התאים (senescence) בדינמיקה של הממברנה, בתעתוק אנדוציטי, בעיבוד ליסוזומלי ובפעילות המערכת החיסונית המולדת, יוצרים מחסומים משמעותיים למסירה יעילה של mRNA. אסטרטגיית התעתוק ההפוך (reverse-transfection) המתוארת כאן פותחה כדי להתגבר על מגבלות אלו על ידי שילוב של הנדסת mRNA מותאמת, הגנה מפני RNase, שיפור הבריחה מהאנדוזומים וחשיפה ישירה של תאים נצמדים לקומפלקסים מוכנים מראש של mRNA-ליפידים. למרות ש-hTERT mRNA משמש כמטען המודלי, זרימת העבודה ישימה באופן רחב למסירה של טרנסקריפטים תרפויטיים גדולים אחרים של mRNA לאוכלוסיות של תאים מזדקנים ותאים שקשה להעביר בהם טרנספקציה20,21,22.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תעתוק In vitro של hTERT mRNA

  1. transcription In vitro (IVT) באמצעות ARCA ו-ΨUTP
    1. הכינו תגובת IVT בנפח 20 µL בהתאם ל-טבלה 1. הגדילו את כמות הרכיבים באופן ליניארי אם נדרשת תנובה גבוהה יותר.
    2. שלבו את כל רכיבי התגובה, למעט T7 RNA polymerase, במבחנה נקייה מ-RNase. הוסיפו את ה-T7 RNA polymerase אחרון, ערבבו בעדינות וסובבו את המבחנה קצרה בצנטריפוגה.
    3. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 0.5–4 שעות.
      הערה: התאימו את זמן הדגירה לאורך התבנית. דגרו תגובות המכילות תבניות קצרות (כ-500 bp) למשך כ-30 דקות ותגובות המכילות תבניות ארוכות יותר (כ-4 kb) למשך 3–4 שעות.
  2. טיפול ב-DNase
    1. הוסיפו 1 µL של DNase I נקי מ-RNase ישירות לתערובת תגובת ה-IVT.
    2. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.
      הערה: יש לבצע את הטיפול ב-DNase ישירות בתגובת ה-IVT ללא טהרה מוקדמת של ה-mRNA המסנתז.
  3. טהרת mRNA
    1. הוסיפו 115 µL של H₂O נקי מנוקלאז כדי לדלל את תערובת התגובה.
    2. טהרו את ה-mRNA באמצעות ערכה לניקוי RNA בהתאם להוראות היצרן.
    3. בצעו אלוטציה (elution) ל-mRNA המטוהר ב-20–30 µL של H₂O נקי מנוקלאז.
    4. מדדו את טוהר ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטריה ואמתו את שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז דנטורטיבי בריכוז 1.0–1.5% או ג'ל פוליאקרילאמיד בריכוז נמוך.
  4. הוספת זנב Poly(A)
    1. הכינו תגובת poly(A)-tailing בנפח 50 µL בהתאם ל-טבלה 2. ערבבו בעדינות את רכיבי התגובה ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30–60 דקות.
      הערה: התאימו את זמן הדגירה לכמות ה-RNA המוכנס.
    2. סיימו את התגובה על ידי הוספה של 2 µL של EDTA בריכוז 0.5 M (pH 8.0).
  5. טהרה סופית ובקרת איכות
    1. טהרו את ה-mRNA עם זנב ה-poly(A) באמצעות ערכה לניקוי RNA בהתאם להוראות היצרן.
    2. בצעו אלוטציה ל-mRNA המטוהר ב-20–30 µL של H₂O נקי מנוקלאז.
    3. העריכו את איכות ה-mRNA לפני המעבר לטרנספקציה
      1. מדדו את ריכוז ה-mRNA באורך גל של 260 nm וקבעו את הטוהר באמצעות היחסים A260/A280 ו-A260/A230. השתמשו בתכונות mRNA עם ערכי A260/A280 של כ-2.0 וערכי A260/A230 הגבוהים מ-2.0.
      2. העריכו את שלמות ה-mRNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או מערכת ניתוח RNA בהתאם להוראות היצרן.
      3. אמתו את אורך זנב ה-poly(A) באמצעות RT-PCR או ניתוח ב-Bioanalyzer. ודאו שאורך זנב ה-poly(A) הוא בין 120 ל-200 נוקליאוטידים.
      4. חלקו את ה-mRNA המטוהר לאליקוואוטים (aliquots) ואחסנו אותם בטמפרטורה של −80 °C כדי לצמצם מחזורי הקפאה-הפשרה.

2. טרנספקציה הפוכה

  1. יום 1-: הכנה לפני טרנספקציה
    1. אימות הפנוטיפ הסנסנטי (senescent phenotype)
      1. בצעו צביעת β-galactosidase המשויכת לסנסנציה (SA-β-gal) על דגימת תאים מייצגת. ודאו כי יותר מ-70% מהתאים חיוביים.
      2. אשרו את הביטוי של סמני סנסנציה (p16 ו-p21) באמצעות qRT-PCR או אימונופלואורסצנציה.
      3. קבעו את חיוניות התאים וודאו שהחיוניות עולה על 90%.
    2. הכנת ריאגנטים
      1. חממו מראש מצע גידול מלא ל-37 °C.
      2. חממו מראש סליין בבופר פוספט (PBS) ל-37 °C.
      3. הכינו מצע Opti-MEM I טרי.
        הערה: אין להוסיף מעכב RNase למצע Opti-MEM I לפני השימוש.
  2. יום 0: יום הטרנספקציה
    הערה: הקצילו כ-3 שעות מהכנת הריאגנטים ועד לדגירה של התאים שעברו טרנספקציה.
    1. הכנת hTERT mRNA
      1. המיסו את ה-hTERT mRNA על קרח. מדדו את ריכוז ה-mRNA והשתמשו בהכנות בעלות ריכוזים שבין 0.5 ל-1.0 µg/µL.
      2. דללו את הכמות הרצויה של hTERT mRNA במצע Opti-MEM I בהתאם לפורמט התרבית שבו נעשה שימוש (טבלה 3). הוסיפו מעכב RNase לריכוז סופי של 0.5–1.0 U/µL וערבבו בעדינות.
      3. שמרו את ה-mRNA המדולל על קרח עד ליצירת הקומפלקס.
        הערה: הוסיפו מעכב RNase רגע לפני השימוש. אין לאחסן mRNA עם מעכב RNase, מכיוון שפעילותו יורדת לאחר הקפאה.
    2. הכנת ריאגנט הטרנספקציה
      1. שלבו 6.0 µL של ריאגנט טרנספקציה עם 100 µL של Opti-MEM I במבחנה סטרילית נקייה מ-RNase. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטור.
      2. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
        הערה: עבור מבני hTERT mRNA גדולים (~5 kb), אופטימיזו את יחסי הריאגנט ל-mRNA לטווח שבין 0.4 ל-0.6 µL ריאגנט לכל 100 ng mRNA.
    3. יצירת קומפלקס mRNA-ליפיד
      1. הוסיפו את תמיסת hTERT mRNA המדוללת (100 µL) לתמיסת ריאגנט הטרנספקציה המדוללת (106 µL). ערבבו בעדינות על ידי פיפטור 5–6 פעמים.
      2. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות.
      3. אין לחרוג מ-30 דקות של יצירת קומפלקסים.
      4. אשרו את הצלחת יצירת הקומפלקס על ידי הופעת תמיסה עכורה קלות.
        הערה: בצעו את הכנת התאים במהלך תקופת יצירת הקומפלקס.
    4. הכנת תאים לטרנספקציה הפוכה (reverse transfection)
      1. שאבו את מצע הגידול מתרביות תאים סנסנטיות.
      2. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש (2 mL לכל באר בלוח של 6 בארות).
      3. הוסיפו 500 µL של 0.05% trypsin-EDTA לכל באר.
      4. דגרו את התאים ב-37 °C למשך 3–5 דקות.
      5. נטרלו את הטריפסין עם 3 mL של מצע מלא המכיל סרום.
      6. בצעו טריטורציה עדינה לתאים כדי לקבל תמיחת תאים בודדים.
      7. קבעו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי.
      8. הכינו תמיחה המכילה 2.0–2.5 × 105 תאים לבאר במצע מלא.
        הערה: הימנעו מטריפסינציה ממושכת מכיוון שתאים סנסנטיים רגישים מאוד למעמקה מכני. שמרו את התאים בתמיחה; אין לזרוע אותם לפני הטרנספקציה ההפוכה.
    5. טרנספקציה הפוכה
      1. הכנת לוח התרבית
        1. הוסיפו 500 µL של 0.01% poly-L-lysine לכל באר בלוח של 6 בארות ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        2. שאבו את תמיסą הציפוי רגע לפני השימוש.
        3. הוסיפו 200 µL של קומפלקס hTERT mRNA-ליפיד למרכז כל באר.
        4. דגרו את הלוח ב-37 °C וב-5% CO₂ למשך 30 דקות.
          הערה: בצעו את ציפוי הלוח במקביל ליצירת הקומפלקס ולהכנת התאים.
      2. הכנת תמיחת התאים
        1. השעו 2.0–2.5 × 105 תאים ב-1800 µL של מצע מלא ללא אנטיביוטיקה.
        2. השעו את התאים בעדינות כדי לקבל תמיחת תאים בודדים אחידה.
          הערה: השתמשו במצע ללא אנטיביוטיקה במהלך הטרנספקציה.
      3. זריעת תאים על הקומפלקסים
        1. הוסיפו 1800 µL של תמיחת התאים ישירות על קומפלקסי ה-hTERT mRNA-ליפיד שהוכנו מראש.
        2. הטו בעדינות את הלוח 2–3 פעמים לכל כיוון כדי לפזר את התאים באופן שווה.
          הערה: אין להשתמש בפיפטור לתמיחה לאחר הוספת התאים, שכן הדבר עלול לשבש את קומפלקסי ה-mRNA-ליפיד.
      4. דגירת תאים
        1. דגרו את התאים ב-37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ למשך 6–8 שעות.
        2. עקבו אחר היצמדות התאים באמצעות מיקרוסקופ אור 2–3 שעות לאחר הטרנספקציה.
        3. וודאו שהתאים מפוזרים באופן שווה ומתחילים להיצמד למשטח התרבית.
          הערה: מספר מופרז של תאים צפים או שיירי תאים עשוי להעיד על ציטוטוקסיות הקשורה לטרנספקציה.

3. הפחתת ציטוטוקסיות

  1. קצרו את תקופת החשיפה לטרנספקציה ל-48 h אם אובדן התאים עולה על 20%.
  2. הוסיפו לתרביות 10 µM של מעכב ROCK Y-27632 במהלך תקופת הטרנספקציה כדי לשפר את הישרדות התאים.
  3. לאחר 6–8 h של טרנספקציה, שאבו בזהירות את מצע הטרנספקציה תוך מזעור הפרעת התאים המחוברים חלקית. השאירו כ-100 µL של מצע שארי בכל באר.
  4. הוסיפו לכל באר 1 mL של מצע גידול מלא טרי שחומם מראש ותומlyה ב-15% FBS.
  5. הוסיפו כלורוכין (chloroquine) לריכוז סופי של 10–20 µM מיד לאחר החלפת המצע.
  6. דגרו את התרביות למשך 2 h נוספות ב-37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
  7. החליפו את המצע המכיל כלורוכין במצע גידול מלא טרי.
  8. החזירו את התרביות לאינקובטור להמשך גידול.
    הערה: עקבו אחר מורפולוגיית התאים וחיוניותם לאורך תקופת ההתאוששות. התנתקות מוגברת של תאים או נוכחות שיירי תאים עשויות להעיד על ציטוטוקסיות הקשורה לטרנספקציה.

4. ניתוח לאחר טרנספקציה

  1. הערך את ביטוי חלבון TERT כ-24–48 שעות לאחר הטרנספקציה.
  2. מדוד את רמות חלבון TERT באמצעות western blotting או צביעת immunofluorescence בהתאם לנהלי מעבדה סטנדרטיים.
  3. מדוד את פעילות הטלומרז במהלך אותו פרק זמן באמצעות בדיקת פעילות טלומרז מתאימה.
    הערה: פעילות הטלומרז יורדת בדרך כלל לאחר 48 שעות עקב פירוק של mRNA של hTERT שהועבר באופן זמני.
  4. הערך את אורך הטלומרים 48–72 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות monochrome multiplex quantitative PCR (MMqPCR) או שיטה מקבילה לניתוח אורך טלומרים.
    הערה: ניתן להבחין בהארכה של הטלומרים בעקבות העברה מוצלחת של mRNA של hTERT.
  5. הערך פנוטיפים הקשורים להזדקנות (senescence) ולהצהרה מחדש (rejuvenation) 7 ימים לאחר הטרנספקציה
    1. מדוד את פעילות β-galactosidase הקשורה להזדקנות (SA-β-gal).
    2. מדוד את רמות הביטוי של p16 ו-p21.
    3. הערך את ביטוי Ki67.
    4. בחן את המורפולוגיה התאית באמצעות מיקרוסקופיה של אור.
      הערה: השווה בין תרבויות שעברו טיפול לבין בקרים מזדקנים שלא טופלו או שעברו טרנספקציה דמה (mock-transfected), כדי להעריך שינויים בפנוטיפים הקשורים להזדקנות ובמאפיינים פרוליפרטיביים.

5. פרוטוקול למתן מינונים חוזרים (אופציונלי)

  1. בצעו את הטרנספקציה הראשונית כפי שמתואר בסעיפים 2–4.
  2. חזרו על הטרנספקציות לפי לוח הזמנים הבא: יום 0: טרנספקציה ראשונה; יום 5: טרנספקציה שנייה; ימים 10–12: טרנספקציה שלישית.
  3. שמרו על התאים כתרביות צמיחה צמודות (adherent) ואל תבצעו טריפסיניזציה לפני טרנספקציות עוקבות.
  4. הכינו קומפלקסים טריים של hTERT mRNA–ליפיד כפי שמתואר בסעיפים 2.2.1–2.2.3.
  5. שאבו את מצע התרבית מכל באער.
  6. הוסיפו 200 µL של קומפלקסים של hTERT mRNA–ליפיד ישירות לכל באער.
  7. הוסיפו 800 µL של מצע F-10 מלא וטרי מיד לאחר הוספת הקומפלקסים.
  8. דגרו את התאים למשך 4–6 h בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂.
  9. החליפו את מצע הטרנספקציה במצע מלא וטרי.
    הערה: הגבילו את הטיפול למקסימום שלושה מחזורי טרנספקציה כדי למזער ציטוטוקסיות מצטברת הקשורה לטרנספקציה.

6. פרוטוקול טרנספקציה קדימה (2 µg/mL, פורמט של 6 באריים)

  1. יום 1-: זריעת תאים
    1. נתקו פיברובלסטים מזדקנים או בשלב התחלה של הזדקנות באמצעות 0.05% trypsin-EDTA.
    2. נטרלו את ה-trypsin באמצעות מצע תרבית מלא.
    3. קבעו את מספר התאים ואת חיוניותם.
    4. זַרְעו את התאים בלוחיות 6-well בצפיפות של 2.0–2.5 × 105 תאים לבאר.
    5. דגרו את התאים למשך לילה ב-37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂ עד שיגיעו לכ-60–80% התמזגות (confluence).
  2. יום 0: הכנת קומפלקסים של hTERT mRNA–reagent
    1. הפשירו מנה של hTERT mRNA עם מודיפיקציית נוקליאוזידים על קרח.
    2. דללו hTERT mRNA ב-Opti-MEM לריכוז סופי של 2 µg/mL במבחנה סטרילית נטולת RNase (מבחנה A).
    3. הוסיפו למבחנה A מעכב RNase לריכוז סופי של 0.5–1.0 U/µL וערבבו בעדינות.
    4. דללו את ריאגנט הטרנספקציה ב-Opti-MEM במבחנה שנייה נטולת RNase (מבחנה B), תוך שימוש ב-0.4–0.6 µL ריאגנט לכל 100 ng mRNA.
    5. הוסיפו את תכולת מבחנה B בטיפות למבחנה A תוך ערבוב עדין.
    6. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות.
  3. יום 0: טרנספקציה קדמית (Forward transfection)
    1. וודאו כי התאים נמצאים ב-60–80% התמזגות ומראים מורפולוגיה בריאה.
    2. שאבו את מצע התרבית.
    3. שטפו את התאים פעם אחת עם 1–2 mL של PBS שחומם מראש.
    4. הוסיפו 0.5 mL של מצע מלא או מצע עם ריכוז סרום מופחת, שחומם מראש, לכל באר.
    5. ניתן להוסיף באופן רשות chloroquine לריכוז סופי של 10–20 µM.
    6. הוסיפו 0.5 mL של קומפלקסי hTERT mRNA–reagent שהוכנו בשלב 6.2.6 לכל באר.
    7. נערו בעדינות את הלוחית כדי להפיץ את הקומפלקסים באופן שווה.
    8. דגרו את התאים למשך 4–6 שעות ב-37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂.
      ​הערה: במידת הצורך, האריכו את תקופת הדגירה ל-6–8 שעות עבור תאים מזדקנים.
    9. שאבו את מצע הטרנספקציה.
    10. הוסיפו 2.0 mL של מצע מלא טרי לכל באר.
    11. בצעו אנליזות לאחר הטרנספקציה כמתואר בסעיף 4.
      הערה: השתמשו באותה סדרת hTERT mRNA, באותו ריאגנט טרנספקציה ובאותו מינון נומינלי בעת השוואת תנאי טרנספקציה קדמית לעומת טרנספקציה הפוכה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-modRNA d2EGFP-T2A-hTERT הונדס כמסגרת קריאה פתוחה היברידית, שבה רפורטר EGFP לא יציב (d2EGFP) קושר ל-TERT אנושי באמצעות פפטיד T2A בעל יכולת פיסול עצמי. הרצפים המלאים של הנוקלאוטידים והחלבונים עבור כל המבנים מופיעים ב-Supplementary File 1. רצף הקידוד הוקף על ידי אזור לא מתורגם (UTR) סינתטי ב-5′ ועל ידי ה-3′ UTR של β-globin אנושי, כדי להגביר את יעילות התרגום ואת יציבות ה-mRNA (איור 1A). קסטת הביטוי הכילה גם רצף מייצב אנזימים סינתטי (Es) ורצף מגביר שעתוק סינתטי (TEs), שנועדו לשפר את הפרוססיביות של T7 polymerase ולהפחית סיום שעתוק מוקדם. לאחר שיבוץ במורד ל-T7 promoter, בוצע שעתוק in vitro באמצעות anti-reverse cap analog (ARCA) ונוקלאוטידים משוערים (m5CTP ו-ΨUTP), ולאחריו הוספת זנב פולי(A) אנזימטי (בקירוב 120–200 nt) כדי לייצר d2EGFP-T2A-hTERT modRNA עם כובע, פוליאדנילציה ושלמות גבוהה (איור 1A).

ניתוח אלקטרופורטי אוטומטי של RNA אישש סינתזה יעילה של התעתק, תוך חשיפת סוג RNA דומיננטי בגודל המצופה עם מינימום של תוצרי פירוק בכמויות קלט שונות, מה שמתיישב עם יצירה מוצלחת של modRNA באורך מלא (איור 1B). בעקבות טרנספקציה של פיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של סנסנציה (senescence) עם 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT modRNA, חלבון hTERT הפך לניתן לזיהוי תוך 24 h ונשאר ברמה גבוהה למשך 48–96 h, מה שמעיד על תרגום מתמשך של התעתק הסינתטי (איור 1C). ניתוח של רפורטר d2EGFP המקושר הדגים פלורסצנציה חזקה בעקבות טרנספקציה הפוכה (reverse transfection), בעוד שפלורסצנציה נמוכה באופן משמעותי נצפתה בעקבות טרנספקציה ישירה (forward transfection) (איור 1D,E). ממצאים אלו מעידים על העברה ואקספרסיה משופרת של hTERT modRNA באמצעות גישת הטרנספקציה ההפוכה בפיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של סנסנציה.

טרנספקציה קדימה (FT) חוזרת של פיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה (הזדקנות תאית) עם modRNA של d2EGFP-T2A-hTERT במרווחי זמן של 5 ימים, הובילה לעלייה הדרגתית באורך הממוצע של הטלומרים (rT/S) ביחס לבקרים שעברו טרנספקציה דמה (mock-transfected), כפי שנמדד באמצעות PCR כמותי מולטיפלקס מונוכרומטי (MMqPCR) (איור 2A). יחס ה-rT/S עלה לאחר כל מחזור FT, כאשר המובהקות הסטטיסטית השתפרה מ-*P < 0.05 ל-**P < 0.01.

יישום של אותו לוח זמנים למינון באמצעות טרנספקציה הפוכה (RT) הוביל לעלייה בולטת יותר באורך הטלומרים. יחס ה-rT/S עלה לאחר כל מחזור RT והגיע להבדלים משמעותיים ביותר ביחס לבקרים שעברו טרנספקציה מדומה (*P < 0.05 עד ****P < 0.0001) (איור 2B). השוואה ישירה בין FT ל-RT לאחר שלושה מחזורי טיפול הדגימה ששתי הגישות העלו באופן משמעותי את ערכי ה-rT/S ביחס לבקרים שעברו טרנספקציה מדומה; עם זאת, RT הביא לעלייה גדולה יותר מאשר FT תחת תנאי מינון ותזמון זהים (*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001) (איור 2C).

ניתוח צמיחה ארוך טווח הדגימה עוד כי מתן חוזר של hTERT modRNA האריך את תוחלת החיים השכפולית (איור 2D). תאים שקיבלו מחזור טיפולי אחד, שניים או שלושה הראו כמות מצטברת גדולה יותר של כפילויות אוכלוסייה באופן הדרגתי בהשוואה לבקרה שעברה טרנספקציה מדומה. תרביות שקיבלו שלושה סבבים של טיפול ב-hTERT modRNA, במיוחד באמצעות RT, הראו את הסטייה הגדולה ביותר מעקומות הצמיחה של הבקרה לאורך כ-250 ימים (עד ****P < 0.0001). חישובי כפילויות האוכלוסייה מוצגים ב-קובץ משלים 2.

פיברובלסטים מסוג LF1 בשלב מוקדם של דעיסה (senescence) שהועברו להם d2EGFP-T2A-hTERT modRNA הפגינו דפוס סולם TRAP חזק 48 שעות לאחר הטרנספקציה, בעוד שתאים שעברו טיפול ב-mock או ב-eGFP-modRNA הראו רק אות רקע, מה שמעיד על כך שפעילות הטלומראז נבעה מביטוי אקסוגני של hTERT (איור 3A). טיפול מקדים בחום ביטל את דפוס הסולם, מה שמאשר את סגוליות הבדיקה (איור 3B).

ניתוח של מהלך הזמן הראה כי פעילות הטלומראז הגיעה לשיאה בין 24 ל-48 שעות לאחר הטרנספקציה ולאחר מכן ירדה, וחזרה לרמות הקרובות לבסיס עד לשעה ה-72–96 (איור 3C). הגברת ריכוז ה-hTERT modRNA מ-50 ל-3,000 ng/mL הובילה לעלייה תואמת בעוצמת אות ה-TRAP, מה שמעיד על הפעלת טלומראז תלויה במינון (איור 3D).

ניתוח תפקודי באמצעות מבני hTERT מסוג פראי (wild-type), לא פעילים קטליתית (CI), וחסרי סיגנל למיקום גרעיני (ΔNLS) הדגים כי רק hTERT מסוג פראי יצר פעילות טלומראז חסונה. שני הגרסאות, CI ו-ΔNLS, נכשלו בהשראת פעילות דומה למרות תנאי העברה דומים (איור 3E). בהתאמה לממצאים אלו, ניתוח MMqPCR חשף עלייה ניכרת באורך הממוצע של הטלומרים (rT/S ≈ 1.4) רק בתאים שקיבלו modRNA של hTERT מסוג פראי. תאים שקיבלו CI-hTERT, ΔNLS-hTERT, או טיפול דמה (mock) נותרו קרובים לרמות הבסיס (rT/S ≈ 0.3; ****P < 0.0001) (איור 3F).

שלושה סבבים עוקבים של טרנספקציה הפוכה עם hTERT modRNA במרווחי זמן של 5 ימים הפחיתו באופן משמעותי את הפרופורציה של תאים חיוביים ל-β-galactosidase המשויך להזדקנות. אחוז התאים החיוביים ירד מכ-85% בתרביות שעברו טיפול דמה (mock) לכ-40% בתרביות שטופלו ב-hTERT, 15 ימים לאחר הטרנספקציה האחרונה (***P < 0.001) (איור 4A).

צביעה אימונוהיסטוכימית קונפוקליתית העלתה ביטוי מוגבר של Ki67 בתאים שעברו שלושה סבבים של טרנספקציה הפוכה של hTERT בהשוואה לבקרה שעברה טיפול מדמה (mock), דבר המעיד על פעילות פרוליפרטיבית מוגברת (איור 4B). ניתוח RT-qPCR הדגים עוד ביטוי מופחת של סמני ההזדקנות p16 ו-p21 בעקבות טיפול ב-hTERT. ביחס לתאים בשלב הזדקנות מוקדם שקיבלו טיפול דמה (mock), ביטוי p16 ירד מכ-2.3-מכפלה ל-0.7-מכפלה, וביטוי p21 ירד מכ-11-מכפלה ל-6-מכפלה (**P < 0.01; ****P < 0.0001) (איור 4C,D). איור משלים 1 מדגימה עוד כי טיפול בכלורוקווין (CQ) או ב-Y-27632 לבדם לא שינה באופן משמעותי את הביטוי של p16 או p21 בתאים שעברו טרנספקציה מדומה (mock-transfected). לעומת זאת, השילוב של CQ ו-Y-27632 במהלך שלושה סבבים של טרנספקציה הפוכה של hTERT הוביל להפחתה הגדולה ביותר בביטוי של p16 ו-p21, בהשוואה לטרנספקציה הפוכה של hTERT לבדה או לטיפול בכל אחד מהחומרים באופן בודד, בעוד שטיפול בחומר בודד הניב השפעות ביניים. ממצאים אלו מעידים כי שימוש משולב ב-CQ וב-Y-27632 הגביר את ההפחתה בביטוי של סמני התיישנות (senescence-associated markers) בעקבות טרנספקציה הפוכה של mRNA של hTERT. יחד, ממצאים אלו מדגימים כי טרנספקציה הפוכה חוזרת של mRNA של hTERT מקדמת הארכת טלומרים, מפחיתה סמני התיישנות ומשפרת מאפיינים פרוליפרטיביים בפיברובלסטים מסוג LF1 בשלב התיישנות מוקדם.

figure-results-1
איור 1: תכנון, סינתזה ותיקוף פונקציונלי של mRNA מסוג d2EGFP‑T2A‑ hTERT בפיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של דעיכה (senescence). (A) תרשים של מבנה ה-mRNA ההיברידי של hTERT המכיל קסטה של d2EGFP המקושרת לפפטיד T2A, לצורך ביטוי סימולטני של hTERT ו-EGFP לא יציב. ה-ORF של d2EGFP-T2A-hTERT מוקף על ידי ה-3’ UTR של הגן β globin האנושי (HBB) ו-5’ UTR סינתטי. ה-mRNA סונתז באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה, ובסיום נוסף זנב poly (A). (B) סינתזה יעילה של mRNA מסוג d2EGFP-T2A-hTERT בעל שלמות גבוהה באמצעות תמלול in vitro, כפי שנותח בבדיקה אלקטרופורטית אוטומטית של RNA. (C) ניתוח מהלך זמן של ביטוי חלבון hTERT באמצעות בדיקת אימונו-סיי (immunoassay) אוטומטית מבוססת קפילריות לאחר טרנספקציה של 2 µg/mL של mRNA מסוג d2EGFP-T2A-hTERT. (D) היעילות והביטוי של טרנספקציית mRNA מסוג d2EGFP-T2A-hTERT, כפי שנבחנו על ידי ביטוי EGFP בין טרנספקציה קדימה (FT) לטרנספקציה הפוכה (RT), נבדקו בפיברובלסטים דיפלואידיים ראשוניים בשלב דעיכה מוקדם (LF1). סרגל קנה מידה = 10 µm. (E) כימות עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת (MFI) של אות eGFP לאחר טרנספקציה קדימה או הפוכה. סך של 20 תמונות בודדות נותחו עבור כל תנאי, הכוללות 4 אזורים נפרדים מ-5 חזרות ביולוגיות. הנתונים מייצגים ממוצעים ± SD. **P < 0.01; כפי שנוערך במבחן t לא מזווג עם תיקון של Welch. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דינמיקת אורך הטלומרים ותוחלת חיים פרוליפרטיבית לאחר טרנספקציה חוזרת של mRNA של hTERT בכיוון קדימה לעומת כיוון אחורי בפיברובלסטים מסוג LF1 בשלב התחלה של סנסנציה. (A) אורכי הטלומרים הממוצעים (rT/S) נקבעו באמצעות Telomere MMqPCR. פיברובלסטים בשלב התחלה של סנסנציה עברו טרנספקציה קדימה (FT) עם mRNA של d2EGFP-T2A-hTERT שלוש פעמים ברצף במרווחי 5 ימים, החל מהכפלת אוכלוסייה (PD) מספר 76. פס השגיאה מציין SEM; n = 5 חזרות ביולוגיות; *P < 0.05, **P < 0.01 בהשוואה לתאים שטופלו ב-mock בלבד. (B) בדומה ל-(A), rT/S הוערכו כאשר תאים בשלב התחלה של סנסנציה עברו טרנספקציות חוזרות (RT) עם mRNA של d2EGFP-T2A-hTERT שלוש פעמים ברצף במרווחי 5 ימים, החל מהכפלת אוכלוסייה (PD) מספר 76. פס השגיאה מייצג SEM; n = 7 חזרות ביולוגיות; *P < 0.05, ****P < 0.0001 בהשוואה לתאים שטופלו ב-mock בלבד. (C) השוואת אורך הטלומרים הממוצע (rT/S) לאחר 3 טרנספקציות קדימה ואחורה ברצף במרווחי 5 ימים, או mock בלבד. פס השגיאה מייצג SEM; n = 10 חזרות ביולוגיות; *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (D) עקומות גדילה של פיברובלסטים מסוג LF1 שעברו טרנספקציה עם 2 µg/ml mRNA של d2EGFP-T2A-hTERT או mock בלבד, פעם אחת, פעמיים או שלוש פעמים ברצף במרווחי 5 ימים החל מ-PD# 76. חצים שחורים מציינים את מועדי הטיפולים. עקומות הגדילה חזרו שלוש פעמים, כאשר כל אוכלוסייה תורשבה בשלוש כפולות. 3 חזרות טכניות לכל דגימה ביולוגית, הנתונים מייצגים ממוצעים ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01; ****P < 0.0001, כפי שהוערך באמצעות מבחני Brown-Forsythe ו-Welch’s ANOVA אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-3
איור 3: mRNA של hTERT פעיל קטליטית, הממוקם בגרעין, מניע עלייה חולפת ותלוית-מינון בפעילות הטלומרז, אשר כשלעצמה מספיקה כדי לקדם הארכה מדידה של הטלומרים בפיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה. (A) תאים בשלב מוקדם של סנצנציה עברו טרנספקציה עם mock, eGFP, או mRNA של d2EGFP-T2A-hTERT. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, הוכן תמצית תאים מ-20,000 תאים והיא הוכפפה לבדיקת TRAP. תוצרי התגובה הריצו ב-PAGE נייטרלי ונצבעו ב-SYBR Green. (B) השבתה של טלומרז באמצעות חום כפי שנמדדה באמצעות בדיקת TRAP. (C) ניתוח של פעילות הטלומרז לאורך זמן בתאי LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה בעקבות טרנספקציה של mRNA של hTERT הראה כי הפעילות חזרה לרמת הבסיס בתוך 72 שעות, מה שמעיד על הפעלה זמנית של האנזים. (D) תאי LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה קיבלו כמויות משתנות של mRNA של d2EGFP-T2A-hTERT (0–3,000 ng/mL), והראו עלייה בפעילות הטלומרז באופן פרופורציונלי למינון. (E) הולכה של 2 µg/ml TERT הגבירה את פעילות הטלומרז בתאי LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה. ΔNLS הגביר חלקית את פעילות הטלומרז ללא השראה של הארכת טלומרים, מכיוון שהוא פועל בציטופלסמה אך אינו עובר לגרעין, בעוד ש-mRNA של CI TERT לא עורר אפקט זה, מה שמעיד על תוצאות תפקודיות שונות. (F) השפעת טרנספקציה הפוכה של TERT תפקודי, TERT חסר סיגנל למיקום גרעיני (ΔNLS), ו-TERT שאינו פעיל קטליטית (CI) על אורכי הטלומרים הממוצעים (rT/S) של תאי LF1 בשלב מוקדם של סנצנציה, המעידה על חשיבותו של TERT פעיל קטליטית הממוקם בגרעין להארכת הטלומרים. סרגל השגיאה מייצג SD; n = 7 חזרות ביולוגיות; ****P < 0.0001 בהשוואה לתאים שטופלו ב-mocks בלבד, כפי שהוערך באמצעות one-way ANOVA עם תיקון Welch. RTA%-פעילות טלומרז יחסית (% מהביקורת) מצוינת בתחתית כל נתיב. היחס בין רמות העוצמה של סולמי דגימות ה-TRAP לבין פס ה-ITAS (ביקורת פנימית- IC) חושב לפי הנוסחה הבאה עבור כל נתיב: Activity normalized = Ladder intensity/ IC intensity וכל דגימה נורמלה לביקורת החיובית כאחוז (ביקורת חיובית; 2,500 תאי H1299) באמצעות הנוסחה הבאה: Relative activity (%) =Activity normalized (sample)/ Activity normalized (reference). חיסור רקע הוחל בכל שלב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: טרנספקציה הפוכה אופטימלית של hTERT mRNA הופכת חלקית פנוטיפים הקשורים להזדקנות ומחדשת סממנים של פרוליפרציה בפיברובלסטים LF1 בשלב מוקדם של הזדקנות. (A) תמונות מייצגות של תאי LF1 בשלב מוקדם של הזדקנות המבטאים β-gal לאחר טרנספקציה של hTERT mRNA משוכלל 3 פעמים ברציפות במרווחי 5 ימים. סרגל קנה מידה = 100 µm. ביטוי β-gal נבדק 15 ימים לאחר הטרנספקציה האחרונה. הניסויים בוצעו שלוש פעמים עם >100 תאים לדגימה שנספרו ידנית. (B) תמונות קונפוקאליות מייצגות (הגדלה של 20x) של תאי LF1 בשלב מוקדם של הזדקנות, שצבעו סמן הפרוליפרציה Ki67. סרגל קנה מידה = 100 µm. עלייה משמעותית בביטוי Ki-67 לאחר 3 סבבים של טרנספקציה הפוכה של hTERT. אחוז הגרעינים החיוביים ל-Ki67 עולה באופן משמעותי לאחר 3× hTERT (RT). הגרף מייצג את הממוצע ± SD של ספירת הגרעינים החיוביים ל-Ki67, מנורמל למצב של טרנספקציית Mock. עבור כל תנאי, נבחנו בסך הכל 18 תמונות, כאשר 6 שדות נבחרים מכל אחד מהחזרים הביולוגיים, לסך של n = 3 חזרים ביולוגיים. ****P < 0.0001. (C) ביטוי סממני הזדקנות לאחר הצעירה חלקית בתיווך של 3× hTERT כפי שנמדד ב-RT-qPCR (n = 6). כל הנתונים מייצגים ממוצעים ± SD. **P < 0.01; ****P < 0.0001, כפי שנמדד ב-t-test לא מזווג עם תיקון Welch. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

רכיבנפח/ריכוז סופי
DNA תבנית ל-PCR200 –1000 ng
10× IVT Buffer2 μL
ATP (100 mM)2 μL (10 mM סופי)
GTP (100 mM)1.5 μL (7.5 mM סופי)
CTP (100 mM)2 μL (10 mM סופי)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)2 μL (10 mM סופי) (ניתן להגדיל את שילוב ה-pseudo-UTP על ידי שילוב UTP רגיל ביחס של 1:4-2:2 (m1Ψ-5′-TP:UTP).)
ARCA (10 mM)4 μL (2 mM סופי)
מעכב RNase (40 U/μL)0.5 μL (20 U)
T7 RNA Polymerase (50 U/μL)2 μL (100 U)
H₂O נקי מנוקלאז 20 μL

טבלה 1: הרכב תגובת השעתוק במבחנה (IVT) לסנתזה של mRNA של hTERT עם מודיפיקציות של נוקלאוזידים. רכיבי התגובה והכמויות הסופיות ששימשה לסנתזה של IVT עם כיסוי ARCA מפורטים בטבלה.

רכיבנפח/ריכוז סופי
mRNA מטוהר עד 5 μg≤20 μL
10× Poly(A) Tailing Buffer5 μL
ATP (10 mM5 μL (1 mM סופי) (למרות שזה כבר נמצא בבופר, התוספת הנוספת מסייעת לייצוב ה-poly A.)
Poly(A) Polymerase (5 U/μL)1 μL (5 U)
H₂O נטול נוקליאזעד לנפח סופי של 50 μL

טבלה 2: הרכב תגובת ה-poly(A)-tailing המשמשת למודיפיקציה פוסט-טרנסקריפציונית של hTERT mRNA. מוצגים נפחי הריאגנטים ותנאי התגובה ליצירת זנב poly(A) באורך 120–200 נוקלאוטידים.

פרמטרפורמט של 12 בארותפורמט של 6 בארות
שטח פני גדילה~3.8 cm²~9.5 cm²
מדיה לכל בארה1.0 mL2.0 mL
מספר זריעת תאים5× 104–6.5× 104 Cells/ml2.0–2.5 × 10⁵
מספר תאים ממוצע (ב-100% confluency)5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml2.9–3 × 10⁵
כמות mRNA לטרנספקציה750 –1000ng2000–3500 ng
חומר טרנספקציה ל-mRNA1.5 – 3.0 µL4.75 – 7 µL
נפח סופי של mRNA + חומר טרנספקציה ב-Opti-MEM50 µL200 µL

טבלה 3: פרמטרי טרנספקציה מומלצים להעברת mRNA של hTERT בפורמטים של תרביות ב-6 בארות וב-12 בארות. מוצגים סיכומי צפיפויות זריעת תאים, כמויות mRNA, נפחי ריאגנט טרנספקציה ונפחי היווצרות קומפלקסים ששימשו בניסויי טרנספקציה ישירה (forward) והפוכה (reverse).

איור משלים 1: השפעת כלורוקווין ו-Y-27632 על ביטוי p16 ו-p21 הקשורים להזדקנות תאית בעקבות טרנספקציה הפוכה חוזרת של hTERT mRNA. (A) ניתוח Quantitative RT-PCR של ביטוי p16 mRNA בפיברובלסטים LF1 שעברו טיפול דמה (mock) או טרנספקציה הפוכה (RT) של 3× hTERT, לאחר טיפול בכלורוקווין (CQ), Y-27632, או שילוב של שניהם, כפי שצוין. (B) ניתוח Quantitative RT-PCR של ביטוי p21 mRNA תחת אותם תנאים ניסיוניים. רמות התמלול נורמלו ל-RpL13a והובאו ביחס לתאי בקרה צעירים (PD#12). נקודות נתונים בודדות מייצגות חזרות ביולוגיות. הנתונים מייצגים ממוצעים ± SD מ-n = 2 חזרות ביולוגיות, עם 5 חזרות טכניות לכל חזרה ביולוגית. מובהקות סטטיסטית מצוינת באיור; ns, לא מובהק. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001, כפי שנקבע על ידי מבחני Brown–Forsythe ו-Welch's ANOVA. קיצורים: CQ, כלורוקווין; RT, טרנספקציה הפוכה; Y-27632, מעכב של Rho-associated protein kinase (ROCK).אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 1: רצפי DNA וחלבון של מבני ביטוי hTERT.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 2: חישוב הכפלות אוכלוסייה (PD). הכפלות אוכלוסייה (PD) חושבו באמצעות הנוסחה PD = log₂ (Nf/N₀), כאשר N₀ הוא מספר התאים שנזרעו, ו-Nf הוא מספר התאים החיוניים שנאספו. PD מצטבר נקבע על ידי סכימת ערכי ה-PD לאורך המעברים.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מגדיר מחדש את ההזדקנות התאית (cellular senescence) כבעיית הובלה (delivery) מובחנת, ולא כווריאציה מינורית של פיזיולוגיה פרוליפראטיבית, ומפתח אסטרטגיית טרנספקציה של mRNA של טלומראז המותאמת למגבלות הביופיזיות והאימונולוגיות של המצב הסנסנטי. תאים סנסנטיים מציגים ממברנות נוקשות ועשירות כולסטרול ופעילות אנדוציטית מופחתת, המהוות מחסום משמעותי להובלה יעילה של חומצות גרעיניות. על ידי אימוץ גישת טרנספקציה הפוכה (reverse-transfection), פרוטוקול זה מנצל את תקופת ההיצמדות החולפת שבה התאים הסנסנטיים עוברים עיצוב מחדש של הממברנה ומראים פלסטיות ממברנלית מוגברת, ובכך מסנכרן את המגע בין התא לקומפלקס עם תקופה של פוטנציאל ספיגה מוגבר3,4. תוצאות מייצגות מדגימות כי אסטרטגיה זו משפרת את ההובלה והביטוי של hTERT modRNA בהשוואה לטרנספקציה רגילה (forward transfection), מה שמוביל להארכה רבה יותר של הטלומרים ופנוטיפים בולטים יותר הקשורים להשבחה (rejuvenation).

מאפיין מרכזי של השיטה הוא אסטרטגיית הנדסה רב-שכבתית של mRNA שנועדה להתגבר על שלושה חסמים עיקריים בתאים מזדקנים (senescent cells): סיגנלינג מוגבר של מערכת החיסון המולדת, עלייה בניוון ה-RNA ופגיעה ביכולת התרגום23,24,25. שילוב של pseudouridine ו-5-methylcytidine מפחית את הפעלת נתיבי הסיגנלינג של TLR3, TLR7/8 ו-RIG-I, ובמקביל משפר את יציבות התמליל ואת יעילות התרגום13,26. כapping מסוג ARCA ואופטימיזציה של זנב poly(A) משפרים עוד יותר את יציבות התמליל ואת תוצר התרגום, ובכך מאפשרים ביטוי חזק אך זמני של hTERT. בדומה למחקרים קודמים, שינויים אלו תומכים בביטוי יעיל של טלומרז תוך מזעור הפעלת מערכת החיסון המולדת הנלווית להחדרה של RNA אקסוגני.

הפרוטוקול מטפל גם בסביבה החוץ-תאית העשירה ב-RNase האופיינית לתרביות של תאים מזדקנים (senescent)27. הגנת ה-RNA מוגברת באמצעות מודיפיקציה של נוקלאוסידים, יצירת קומפלקסים ליפידיים, והוספה מיידית של מעכב RNase לפני הטרנספקציה. בנוסף, עיתוי הטרנספקציה ההפוכה (reverse transfection) הותאם לקינטיקת ההיצמדות האיטית יותר של תאים מזדקנים, מה שמאפשר אינטראקציה ממושכת בין התאים לבין קומפלקסי mRNA-ליפיד במהלך היצמדות התאים. שינויים אלו משפרים יחד את ההסתברות לספיגה מוצלחת של המטען באוכלוסיית תאים שקשה לבצע לה טרנספקציה בדרכים אחרות.

בריחה מאנדוזומים מהווה צוואר בקבוק קריטי שני להחדרה של mRNA בתאים מזקינים. תאים מזקינים מראים תכולה ליזוזומלית מוגברת ותעתוע מוגבר של מטען שעבר אנדוציטוזה לעבר מדורי פירוק17,28. חשיפה זמנית לכלורוקווין במהלך התקופה המוקדמת לאחר התעתוק משפרת את ההחדרה הפונקציונלית על ידי קידום הבריחה מהאנדוזומים והפחתת פירוק ליזוזומלי של mRNA שהופנם. למרות שהמינון האופטימלי ומשך החשיפה עשויים להשתנות בין סוגי תאים שונים, התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך ששיפור הבריחה מהאנדוזומים משפר באופן משמעותי את יעילות ההחדרה בפיברובלסטים מזקינים.

ברמה התפקודית, מתן חוזר של hTERT modRNA הוביל לעלייה מצטברת באורך הטלומרים היחסי, להארכת תוחלת השכפול ולהפחתה של פנוטיפים מרובים הקשורים להזדקנות תאית. תאים שקיבלו טיפול חוזר ב-hTERT הראו פעילות מופחתת של SA-β-gal, ירידה בביטוי של p16 ו-p21, עלייה בביטוי של Ki67 ויכולת רבייה מוגברת בהשוואה לבקרי mock-transfected. באופן משמעותי, פעילות הטלומראז נותרה חולפת, וחזרה לרמות קרובות לבסיס בתוך מספר ימים לאחר הטרנספקציה. פרופיל ביטוי חולף זה מונע שינוי גנטי קבוע ועם זאת מספק פעילות טלומראז מספיקה כדי להניב השפעות ביולוגיות מדידות. עם זאת, יש לציין כי מדידות של אורך טלומרים יחסי שהתקבלו באמצעות MMqPCR אינן מכמתות באופן ישיר את ההארכה המוחלטת של הטלומרים. מחקרים עתידיים שישלבו ניתוח של terminal restriction fragment, היברידיזציה פלואורסצנטית כמותית באתר (quantitative fluorescence in situ hybridization), Flow-FISH או מתודולוגיות TeSLA יספקו הערכה מדויקת יותר של הדינמיקה של אורך הטלומרים בעקבות אספקת hTERT mRNA.

מספר מגבלות מחייבות התייחסות. אוכלוסיות של תאים סניסנטיות הן מטבען הטרוגניות ועשויות להשתנות בתגובתן להחדרה של mRNA, בהתאם לשיטה שבה הושראה הסניסנציה, למקור התורמים ולהיסטוריית התרבית. כתוצאה מכך, יעילות הטרנספקציה ותוצאות ההשבחה עשויות להשתנות בין מערכות ניסוייות שונות. יתרה מכך, הפעלתה מחדש של הטלומראז מתבוננת בעיקר בהיבטים של הזדקנות תאית התלויים בטלומרים, ואינה מתקנת באופן ישיר את כל סימני ההיכר של הסניסנציה. שינויים הקשורים להזדקנות, כגון סחיפה אפיגנטית, תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי, פרוטאוסטזיס משובש ואיתות דלקתי כרוני, עשויים להישאר למרות הארכה מוצלחת של הטלומרים29,30. לפיכך, יש לראות בפרוטוקול זה כלי ממוקד לחקר והפיכה חלקית של סניסנציה מונחית טלומרים, ולא כאסטרטגיית השבחה מקיפה.

הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול זה נועדו לשמש כקווים מנחים מעשיים עבור תאים אנושיים שעברו סנסקנסיה (senescence), והם פותחו באמצעות אופטימיזציה איטרטיבית המבוססת על מחקרים שפורסמו וניסיון ניסיוני. גורמים הכוללים צפיפות תאים, יחס בין ריאגנט הטרנספקציה ל-mRNA, זמן היווצרות הקומפלקס ותנאי בריחה מהאנדוזום עשויים לדרוש התאמה עבור סוגי תאים ספציפיים והגדרות ניסיוניות שונות. לפיכך, על החוקרים להתייחס לתנאים המדווחים כנקודת התחלה לאופטימיזציה ולא כנקודות סיום המערכות באופן אוניברסלי.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק מסגרת הניתנת לשחזור להחדרה של mRNA של hTERT שעבר שינוי לתאים אנושיים במצב של זקנה (senescence), תוך שימוש באסטרטגיה של טרנספקציה הפוכה (reverse-transfection) שעברה אופטימיזציה למאפיינים הפיזיולוגיים של הזקנה התאית. גישה זו מאפשרת הפעלה מחדש זמנית של הטלומרז, הארכה מדידה של הטלומרים, הארכה של תוחלת החיים השכפולית והפיכת חלקית של פנוטיפים הקשורים לזקנה. מחקרים עתידיים צריכים להעריך את ישימותה של אסטרטגיה זו בסוגים נוספים של תאים מזדקנים, לחקור גישות משולבות עם התערבויות התחדשות משלימות, ולבדוק את המעבר לפלטפורמות הובלה in vivo. לפיכך, שיטה זו מהווה כלי בעל ערך לחקר ביולוגיית הטלומרים, התחדשות תאית ומנגנוני זקנה במחקרי הזדקנות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.M.S. הוא מייסד שותף ויו"ר ה-SAB של Transposon Therapeutics.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מספרים P01 AG051449, R01 AG016694, ו-R01 AG078925 שניתנו ל-JS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher11550043מדיה לתרבית תאים.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabS1411Lעבור רוב ה-RNAs, מבנה ה-cap מגביר את היציבות, מפחית את הרגישות לפירוק על ידי exonuclease ומקדם את היווצרותם של קומפלקסים של התחלה של mRNA.
5-Methyl-Cytidine-5´-Triphosphate (5-Methyl-CTP)New England BiolabN0432SNTPs משוכשכים משמשים בדרך כלל להפחתת אימונוגניות עבור RNA בשעתוק in vitro.
6 Well PlateCorning351146לגידול וטיפול בנפחים בינוניים עד גדולים של תאים נצמדים או תאים בתליה בתנאים ניסיוניים נפרדים.
Anti-Ki67 antibody (SP6)abcamab16667Ki67 מובע בעיקר בתאים הנמצאים בשלב התרבשות.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal Staining) cellbiolabsCBA-230 זיהוי של תאים מזדקנים (senescent) באמצעות בדיקת צביעת SA-β-gal
DNA LoBind 0.5ml TubesEppendorf 022431005להשבה יעילה של DNA ו-RNA ללא אובדן
DNA LoBind 1.5ml TubesEppendorf22431021להשבה יעילה של DNA ו-RNA ללא אובדן
DNase I, RNase-free (1 U/μL)Thermo FisherEN0521DNase I, RNase-free הוא endonuclease המעכל DNA בעלי גדילה אחת או שתיים. 
E. coli Poly(A) PolymeraseNew England BiolabM0276Sב-Escherichia coli, Poly(A) Polymerase I (PAP I) מתפקד בעיקר כזרז להוספה שאינה תלוית תבנית של שארי אדנוזין מונופוספיה (AMP) לקצה ה-3' של מולקולות RNA.
Fetal Bovine SerumThermo FisherA5256701תוסף סרום לתרבית תאים 
HiScribe T7 ARCA mRNA KitNew England BiolabE2065Sערכת HiScribe T7 ARCA mRNA (עם tailing) תוכננה לייצור מהיר של mRNA עם cap מסוג ARCA וזנב poly(A) in vitro. mRNA עם cap מסנתזים על ידי שילוב קו-טרנסקריפציונלי של Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) באמצעות T7 RNA Polymerase.
HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AGNew England BiolabE2080Sערכות HiScribe T7 mRNA עם CleanCap Reagent AG מאפשרות ייצור מהיר ויעיל של תמליל אחד או רבים, עם תפוקות טיפוסיות של ≥90 μg לריאקציה,
LongAmp Hot Start Taq DNA PolymeraseNew England BiolabM0534SLongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase מציע ביצועים יוצאי דופן עם amplicons ארוכים.
M-MuLV Reverse TranscriptaseNew England BiolabM0253LM-MuLV Reverse Transcriptase מסנתז גדיל DNA משלים המתחיל מפריימר, תוך שימוש ב-RNA (סינתזה של cDNA) או ב-DNA בעל גדיל אחד כתבנית.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)New England BiolabT2040Lהתפקיד העיקרי של ערכת Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) הוא לטהר ולרכז עד 50 μg של RNA באיכות גבוהה מתגובות אנזימטיות או מתערובות מיצוי.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabE2621LNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix מאפשר הרכבה חלקה של מספר מקטעי DNA, ללא קשר לאורך המקטעים או לתאימות הקצוות. הוא שימושי עבור קהילת הביולוגיה הסינתטית, וכן לשיクלונינג של מספר מקטעים בשלב אחד הודות לקלות השימוש, לגמישות ולפורמט ה-master-mix הפשוט. 
Opti-MEM -Reduced Serum MediumThermo Fisher31985070למקסום יעילות טרנספקציית תאים במהלך היווצרות קומפלקס ליפיד-מטען. הוא משמש כסביבה מוגדרת כימית ואופטימלית השומרת על חיוניות גבוהה של תאי יונקים תוך הפחתת הצורך בתוספת סרום סטנדרטית
PBS, pH 7.4Thermo Fisher10010023השימוש התפקודי העיקרי של Phosphate-Buffered Saline (PBS) ב-pH 7.4 הוא שמירה על pH יציב ואיזון אוסמוטי עבור תאי יונקים ומולקולות ביולוגיות.
PCR StripsThermo FisherAB0776השימוש התפקודי העיקרי של מבחנות PCR ברצועות (בדרך כלל בפורמט של 8 או 12 מבחנות) הוא החזקת תגובות נוזליות בנפחים קטנים במהלך מחזורי תרמיים בעוצמה גבוהה.
Poly-L-Lysine HydrobromideMillipore SigmaP4707-50MLהשימוש התפקודי העיקרי של Poly-L-Lysine (PLL) Hydrobromide להיספח תאים הוא ציפוי משטחים מוצקים בעלי מטען שלילי (כגון זכוכית או פלסטיק) ליצירת מצע דביק מאוד בעל מטען חיובי.
Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP- ΨUTP)New England BiolabN0433SPseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP) משמשים בדרך כלל להפחתת אימונוגניות עבור RNA בשעתוק in vitro.
Ribonucleotide Solution SetNew England BiolabN0450Lארבעה תמיסות נפרדות של ATP, GTP, CTP ו-UTP
ROCK inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)Stem cell technologies72302Y-27632 הוא מעכב חדיר-תאים, רב-עוצמה וסלקטיבי של Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Y-27632 מעכב הן את ROCK1 (Ki = 220 nM) והן את ROCK2 (Ki = 300 nM) על ידי תחרות עם ATP על קישור לאתר הקטליטי 
RT-PCR Grade WaterThermo FisherAM9935השימוש התפקודי העיקרי של RT-PCR Grade Water (המסומן לעיתים כ-Nuclease-Free Water) הוא לשמש כממס אולטרה-טהור עבור בדיקות אנזימטיות רגישות שבהן כל זיהום עלול לפרק את הדגימה או לעכב את ההגברה.
SUPERase·In RNase Inhibitor Thermo FisherAM2694SUPERase In RNase Inhibitor הוא מעכב מבוסס חלבון ממקור שאינו אנושי, הנקשר באופן לא-קוולנטי ומעכב את ה-RNases הנפוצים והבעייתיים ביותר, כולל RNase A, B, C, 1, ו-T1.
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainThermo FisherS7563השימוש התפקודי העיקרי של SYBR™ Green I Nucleic Acid Gel Stain הוא ויזואליזציה וכימות של DNA דו-גדילי (dsDNA) בג'לים של agarose או polyacrylamide.
TransIT-mRNA Transfection KitMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250ריאגנט טרנספקציה בעל יעילות גבוהה ורעילות נמוכה עבור RNA גדול
TRAPeze Telomerase Detection KitMillipore Sigma S7700 בדיקת TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) היא שיטה מבוססת PCR נפוצה ורגישה לזיהוי ומדידה של פעילות טלומראז בתאי יונקים ובדגימות רקמות. היא כוללת שלושה שלבים עיקריים: הארכה של חזרות טלומריות על ידי טלומראז, הגברה של תוצרים אלה באמצעות PCR, וזיהוי עוקב.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300054לניתוק תאי יונקים נצמדים מכלי תרבית במהלך מעבר תאים שגרתי (subculturing) ואיסוף.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNA hTERTmRNARNasepH

מאמרים קשורים