בידוד, טיהור ואפיון של מיטוכונדריה פונקציונלית שמקורן בשריר השלד של העכבר להשתלת מיטוכונדריה

סיכום

הוקם פרוטוקול סטנדרטי המשלב עיכול טריפסין וצנטריפוגציה דיפרנציאלית לבידוד, טיהור ואפיון תפקודי של מיטוכונדריה משריר השלד של העכברים, וכן להערכת יישומם בהשתלת מיטוכונדריה.

תקציר

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים המווסתים את חילוף החומרים של האנרגיה, העברת אותות והומאוסטזיס התאים בתאים אאוקריוטיים. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה תורם לפתוגנזה של מחלות רבות והוביל לפיתוח השתלות מיטוכונדריאלית כאסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית. יישום מוצלח של השתלת מיטוכונדריה תלוי בזמינות של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ושלמה מבחינה פונקציונלית. שריר השלד הוא מקור תורם מתאים בזכות תכולת המטוכונדריה הגבוהה שלו, פעילותו המטבולית והנגישות שלו. מחקר זה קבע פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור לבידוד, טיהור ואפיון של מיטוכונדריה פונקציונלית משרירי שלד של העכברים והעריך את השימוש בהם בהשתלות מיטוכונדריה. ההליך כלל שני שלבים עיקריים. ראשית, המיטוכונדריה בודדה משריר השלד של עכברי C57BL/6 באמצעות עיכול טריפסין ואחריו צנטריפוגציה שונה. שנית, המיטוכונדריות המבודדות אופיינו להערכת טוהר, מבנה על-טבעי ופעילות פונקציונלית. טוהר המיטוכונדריה הוערך באמצעות כימות חלבון בחומצה ביסינכונינית (BCA) וניתוח ווסטרן בלוט. שלמות אולטרה-מבנית נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר. הפעילות התפקודית הוערכה באמצעות JC-1 ותיוג פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי יחד עם מדידות צריכת חמצן, קיבולת ייצור ATP ויחס בקרה נשימתית באמצעות מערכת רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. המיטוכונדריה המבודדת הפגינה פוטנציאל ממברנה משומר, מבנה על-טבעי שלם ופעילות נשימתית יציבה, מה שמעיד על התאמה למחקרים פונקציונליים במורד הזרם וליישומי השתלת מיטוכונדריה.

מבוא

מיטוכונדריה היא האתרים העיקריים לייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) ומשחקת תפקידים מרכזיים באפופטוזיס, הומאוסטזיס סידן והמטבוליזם של מיני חמצן פעילים (ROS). לכן, שלמות המיטוכונדריה חיונית לשמירה על הומאוסטזיס תאי ולקביעת גורל התא ^1,2. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל מוטציות ב-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) וחריגות בשרשרת העברת אלקטרונים (ETC), מובילה לפגיעה במטבוליזם האנרגיה, לחץ חמצוני ואפופטוזיס לא מאוזן ^3,4. חריגות אלו קשורות למגוון רחב של מחלות, כולל הפרעות מיטוכונדריאליות תורשתיות, מחלות ניווניות עצבית^ומחלות לב וכלי ^דם. אסטרטגיות טיפוליות קונבנציונליות לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה, כגון נוגדי חמצון וגורמים מטבוליים, בדרך כלל מספקות יעילות מוגבלת משום שהן מקלות על התסמינים מבלי להחזיר ישירות את תפקוד המיטוכונדריה ^7,8. כתוצאה מכך, השתלות מיטוכונדריה הפכו לגישה טיפולית מבטיחה ברפואה רגנרטיבית. אסטרטגיה זו כוללת העברת מיטוכונדריה חיצונית שלמה לתאים פגומים או דיספונקציונליים כדי לשקם פעילות מיטוכונדרית ומטבוליזם אנרגיה ^תאית. מחקרים קודמים הראו כי מיטוכונדריה אקסוגנית יכולה להיות מופנמת על ידי תאי המקבל ולהיות משולבת ברשת המיטוכונדריה האנדוגנית, מה שמוביל לשיפור התפקוד הביואנרגטי ולשיפור הישרדות התאים 11,12,13.

שריר השלד נחשב לתורם מתאים לבידוד מיטוכונדריאלי בשל תכולתו הגבוהה במיטוכונדריה, פעילות מטבולית ונגישות 14,15,16. השתלת מיטוכונדריה דורשת מספר שלבים קריטיים, כולל בידוד מיטוכונדריה, טיהור, אפיון תפקודי והעברה יעילה לתאי המקבל. עם זאת, נותרה שונות מתודולוגית משמעותית בין הפרוטוקולים שדווחו עד כה, במיוחד בהליכים הכוללים הומוגניזציה של רקמות, עיכול אנזימטי, בקרת טמפרטורה וטיהור. שונות כזו יכולה להשפיע על תפוקת מיטוכונדריה, טוהר ושלמות פונקציונלית, ובכך להגביל את השחזוריות הניסויית.

כדי לשפר עקביות מתודולוגית ויכולת שכפול, מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ואפיון מיטוכונדריה פונקציונלית משריר השלד של העכברים באמצעות עיכול טריפסין וצנטריפוגציה דיפרנציאלית. המיטוכונדריה המבודדת הוערכה לטוהר, שלמות אולטרה-מבנית ופעילות פונקציונלית באמצעות כימות חלבון בחומצה ביצינכונינית (BCA), ווסטרן בלוטינג, מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית, בדיקות פוטנציאל ממברנה מבוססות פלואורסצנציה ורספירומטריה ברזולוציה גבוהה. בנוסף, הוערכה קליטת מיטוכונדריה מבודדת על ידי תאי המקבל כדי להעריך את התאמתם ליישומים של השתלת מיטוכונדריה. פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה שניתן לשחזור לקבלת מיטוכונדריה שמקורם בשרירי שלד פונקציונליים למחקרים ניסיוניים במורד הזרם.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו במתקן ספציפי ללא פתוגנים (SPF) ואושרו על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של בית החולים השלישי המסונף של אוניברסיטת חיל האוויר הרפואית (מס' אישור: IACUC-2024kq-065).

עכברים זכרים מסוג C57BL/6 (בני 6-8 שבועות, 18-20 גרם) נרכשו ממרכז בעלי החיים המעבדתיים של אוניברסיטת חיל האוויר לרפואה (רישיון ייצור: SCXK (שאנשי) 2024-002). העכברים אוחסנו בכלובים מאווררים (IVCs) בלחץ חיובי ובתנאים נקיים, עם טמפרטורה של 20-26 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 40%-70%, מחזור אור-חושך של 12 שעות, ולפחות 15 החלפות אוויר בשעה. סופקו תזונה מעוטאת, מי שתייה והעשרה סביבתית.

המגבים, הכימיקלים והכלים הניסיוניים ששימשו בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. הקרבת בעלי חיים ואיסוף רקמות

1. הניחו את העכבר בתא המתת חסד אטום לאוויר והפכו להמתים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) הדרגתית, נפח תא של 30%-70% לדקה.
2. אישור מוות על ידי הפסקת נשימה ודופק ספונטניים, אובדן רפלקסים אישונים וחוסר תגובה לגירוי מכני.
3. טבלו את עכברי C57BL/6 שהושמתו ב-75% אתנול למשך 5 דקות לחיטוי.
   הערה: כדי למנוע קיבוע רקמתי ונזק תאי כתוצאה מאלכוהול, הגביל את זמן הטבילה ל-10 דקות. השתמש ברקמה טרייה לאורך כל הפרוטוקול כי הקפאה פוגעת בחיוניות ובשלמות התפקודית של המיטוכונדריה.
4. הנח את העכבר בצלחת פטרי סטרילית בתוך קפוצ'ון זרימה למינרי, כאשר הבטן פונה כלפי מעלה, כדי לחשוף במלואו את אזורי הבטן והגפיים האחוריות.
5. הרם את עור הבטן התחתונה ליד אזור המין באמצעות מלקחיים ובצע חתך קטן. בצע ניתוח קהה כדי להפריד את העור מהרקמה שמתחת. הארכי את החתך כלפי מעלה לאורך קו האמצע עד הקרסול ולרוחב לכיוון שתי הגפיים האחוריות כדי לחשוף לחלוטין את שרירי הגפיים האחוריות.
6. זהה את שריר הארבע ראשי הירך בצד הקדמי של הירך והפרד בזהירות את השריר בכיוון סיבי השריר באמצעות דיסקציה קהה. חתכו את הרצועה הפיקה הרחוקה ואת הגיד הפרוקסימלי כדי לבודד לחלוטין את רקמת השריר.
   הערה: שטפו את הרקמה שלוש פעמים בסליין מופעל פוספט מקורר מראש (PBS) עם תוספת של 2% פניצילין-סטרפטומיצין באמצעות צלחת פטרי טרייה בכל שטיפה כדי למזער זיהום.
7. הניחו את רקמת השריר המבודדת מיד ב-PBS מקורר מראש ושטפו היטב כדי להסיר שיער ודם מפני הרקמה.
8. נגב בעדינות לחות עודפת מהרקמה באמצעות גזה סטרילית. חלק את הרקמה לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ושקול את הדגימות. השתמש בכ-100 מ"ג רקמה לכל דגימה כדי לשמור על עקביות בין ההכנות.

2. טחינת רקמות והומוגניזציה

1. הנח את צינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את הרקמה משלב 1.8 על הקרח. חתוך את הרקמה לחתיכות קטנות בגודל של כ-1-2 מ"^{מ 3} באמצעות מספריים סטריליים.
2. הוסף 8 נפחים של טריפסין מקורר מראש ב-0.25% ועכל את שברי הרקמה על קרח למשך 15 דקות.
   הערה: חשב את נפח הטריפסין הנדרש לפי מסת הרקמה (1 מ"ג ≈ 1 מיקרוליטר). לדוגמה, הוסף 640 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ל-80 מ"ג רקמה.
3. צנטריפוגה את התערובת ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליך את הסופרנטנט ושמור את כדור הרקמה. החזירו את הכדור ל-1 מ"ל בופר בידוד מיטוכונדריאלי מקורר מראש המכיל D-מניטול (215 מ"מ), סוכרוז (75 מ"מ), HEPES (20 מ"מ), EGTA (1 מ"מ) ואלבמין בקר ללא חומצות שומן (0.5% עם חומצות שומן).
4. העבר את המתלים למכשיר זכוכית שהומוגני על הקרח. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות 10-12 תנועות עדינות למעלה ולמטה עד שהתלייה הופכת לעכורה.
   הערה: הימנעו מסיבוב העלי הזכוכית לרוחב בתחתית ההומוגניזר כי כוח מכני מופרז עלול לפגוע בממברנות המיטוכונדריה ולפגוע בתפקוד המיטוכונדריאה.

3. צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. העבר את ההומוגנט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לקבל את הכדור המיטוכונדריאלי הגולמי.
   הערה: אספו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות מזרק בנפח 1 מ"ל תוך הימנעות מהפרעה לכדור ולשאריות רקמה.

4. טיהור ואחסון מיטוכונדריאלי

1. החזירו בעדינות את הכדור המטוכונדריאלי הגס בבופר שטיפה מקורר מראש המכיל סוכרוז (250 מ"מ), HEPES (10 מ"מ, pH 7.4), EGTA (1 מ"מ) ואלבמין סרום בקר (0.15% w/v). צנטריפוגה את המתלים בעוצמה של 1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. העבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה טרי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לקבל את הכדור המטוהר של המיטוכונדריה.
   הערה: השתמש במיטוכונדריה מבודדת טרית מיד כשאפשר. אחסון קצר טווח בטמפרטורה של 4°C או אחסון ארוך טווח ב-−80°C בבופר אחסון מיטוכונדריאלי המכיל סוכרוז (0.25 מ'), Tris-MOPS (10 מ"מ, pH 7.4) ו-EGTA (0.1 מ"מ) אפשרי. עם זאת, הקפאה עלולה לפגוע בפעילות האנזימטית של המיטוכונדריה ובתפקוד הנשימה. השתמש בדגימות קפואות בעיקר לניתוח חלבונים.

5. הפקת חלבונים מיטוכונדריאלית וציטוזולית וכימות BCA

1. הפקת חלבון מיטוכונדריאלי
   1. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי המטוהר ב-50 מיקרוליטר של בופר ליזיס RIPA לכל 100 מ"ג של רקמת התחלה ודחפו את הכדור על קרח למשך 15 דקות.
   2. צנטריפוגה את הליזאט בכ-14,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל כדי לקבל את שבר החלבון המיטוכונדריאלי.
2. הפקת חלבון ציטוזולי
   1. בצנטריפוגה הסופרנטנט הציטוזולי שהושג בשלב 4.2 ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על הכדור כחלק הציטוזולי המועשר.
   2. החזירו את הכדור הציטוזולי ל-50 מיקרוליטר של בופר ליזיס RIPA ועבדו את הדגימה כפי שמתואר בשלבים 5.1.1-5.1.2.
      הערה: הכינו את בופר הליזיס טרי עם מעכבי פרוטאז ובצעו את כל ההליכים על קרח כדי למזער את פירוק החלבון. המיטוכונדריה בשלב זה יכולה להיות טרייה או קפואה.
3. כימות חלבון BCA
   1. הכינו את תמיסת העבודה של BCA על ידי ערבוב תגובת A וריגנט B ביחס של 50:1 (v/v). הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לכל באר של לוח עם 96 בארות.
      הערה: הכינו את תמיסת ה-BCA הפועלת מיד לפני השימוש והשתמשו בה תוך שעה בטמפרטורת החדר.
   2. מדלל את תמיסת המאגר של אלבומין הסרום (BSA) (2 מ"ג/מ"ל) ל-0.5 מ"ג/מ"ל והשאיר את התמיסה על הקרח עד השימוש.
   3. הכינו את העקומה הסטנדרטית על ידי הוספת 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 או 0 מיקרוליטר של פתרון BSA לבארות נפרדות. כוון את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר באמצעות תמיסת NaCl.
   4. הוסף 4 מיקרוליטר חלבון מיטוכונדריאלי ו-16 מיקרוליטר תמיסת NaCl לקבוצת בארות אחת. הוסיפו 4 מיקרוליטר חלבון ציטוזולי ו-16 מיקרוליטר תמיסת NaCl לקבוצת בארות אחרת.
   5. הוסיפו 200 מיקרולטר של תמיסת BCA לכל באר ודגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות. מדדו את הספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
   6. בנו עקומת תקן חלבון עם מקדם קורלציה (R²) ≥ 0.999. חשב ריכוזי חלבונים (μg/μL) על ידי אינטרפולציה של ערכי הספיגה מהעקומה הסטנדרטית.

6. הערכת טוהר של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי השלד

1. לדלל דגימות חלבון מיטוכונדריאלי וציטוזולי לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר. הכין תערובות תגובה של 20 מיקרוליטר המכילות 30 מיקרוגרם חלבון ו-4 בופר עומס ×. כוון את הווליום שנותר עם תמיסת NaCl. הרתיחו את הדגימות במשך 10 דקות ואחסנו אותן בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש.
2. הפרדו דגימות חלבון באמצעות ג'לים מוכנים עם 4%-20% גרדיאנט. בצע אלקטרופורזה ב-140-150 וולט למשך 50 דקות.
3. הפעל את ממברנת ה-PVDF (0.22 מיקרון) במתנול למשך דקה. חלבוני העברה משתמשים בבופר ההעברה המהירה ב-400 mA למשך 30 דקות.
4. הסר את ממברנת ה-PVDF מסנדוויץ' ההעברה ושוטף אותו ב-TBST למשך 5 דקות. חסום את הממברנה עם חלב רזה של 5% בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ניעור עדין.
5. דילול נוגדנים ראשוניים (COX IV, ציטוכרום c, β-אקטין) 1:1,000 בבופר דילול נוגדנים. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות בכל כביסה.
7. דגרו את הממברנה עם נוגדנים משניים מדוללים ב-1:10,000 בטמפרטורת החדר למשך שעה.
8. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות כל אחת. פתח את הכתם ותצלום את התמונות.

7. צביעת MitoTracker של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי שלד

1. מדלל את תמיסת הצביעה לריכוז סופי של 200 ננומטר במדיום מחומם מראש מיד לפני השימוש.
2. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי ל-100 מיקרו-ליטר של תמיסת העבודה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות.
3. הוסיפו חמישה נפחים של בופר אחסון מקורר מראש לאחר הדגירה. צנטריפוגה את המתלה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט המכיל צבע לא קשור.
4. העבר אליקווט של המתלה המיטוכונדריאלי המוצבע למחסנית זכוכית וכסה את הדגימה בכיסוי.
5. צלם תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם הגדרות עירור ופליטה מתאימות לזיהוי צבע מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי אדום.

8. הערכת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית באמצעות צביעת JC-1

1. קבוצת הטיפול CCCP (ציאניד קרבוניל m-chlorophenyl hydrazone)
   1. לטפל בהשעיה המיטוכונדריאלית עם CCCP בריכוז סופי של 10 מיקרומולר ולדוגר במשך 20 דקות כדי לפזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.
   2. דגרו את הטיפול המיטוכונדרי המטופל ב-CCCP עם 250 מיקרוליטר של תמיסת צביעת JC-1 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם ערבוב עדין.
2. קבוצת הטיפול JC-1
   1. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי ל-100 מיקרוליטר של תמיסת JC-1 ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגן מאור.
   2. הכינו 1× בופר צביעה JC-1 על ידי דילול תמיסת המלאי 5× במים מזוקקים ביחס של 2:8 (v/v) ושמרו על הבופר על קרח.
   3. הסר את תמיסת הצביעה ושוטף את הפלט המיטוכונדריאלי פעמיים עם בופר צביעה 1× JC-1 מקורר מראש.
   4. החזירו את המיטוכונדריה המוכתמת ל-PBS וצילמו אותן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. השתמש בהגדרות עירור ופליטה מתאימות לזיהוי מונומרים ירוקים של JC-1 פלואורסצנטי ואגרגטים אדומים פלואורסצנטיים של JC-1.

9. ניתוח אולטרה-מבני של מיטוכונדריה מבודדת של שרירי השלד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר

1. מקבע מיטוכונדריה מבודדת טרייה ב-2.5% גלוטראלדהיד שהוכן בבופר פוספט של 0.2 מ' (pH 7.4) ודגור את הדגימות ללילה בטמפרטורה של 4°C.
2. שטפו את הדגימות ב-0.1 מיליון מלח עם בופר פוספט (PBS, pH 7.4) וקיבעו את הדגימות לאחר מכן בטטרוקסיד אוסמיום 1% למשך שעה בטמפרטורת החדר.
3. ייבוש הדגימות באמצעות סדרת אתנול מדורגת, ואחריה חדירה, הטמעה ופולימריזציה בשרף אפוקסי.
4. חתך את הדגימות המשובצות בעובי של 50-70 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום.
5. צבע כפול את החלקים עם אורניל אצטט ועופרת ציטראט. התבונן וצלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר.

10. קליטה תאית של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי השלד

1. שיבוט תרבות NCTC 929 (L929; RRID: CVCL_0462) תאים שהתקבלו מספק מסחרי במדיום מלא המכיל MEM Alpha, בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. כאשר התאים מגיעים ל-80%-90% מפגש (מפגש בין 80%), שאיפת המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש. הוסף טריפסין-EDTA ודוגר עד שהתאים מתנתקים.
3. הוסיפו מדיום מלא לסיום העיכול ויוצרים תלייה חד-תאית באמצעות פיפטינג עדין. צנטריפוגה את המתלים ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות וזרקו את הסופרנטנט.
4. החזירו את כדור התא למדיום טרי ומלא וזרעו את התאים לכלי תרבית חדשים בצפיפות מתאימה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
5. זרעים מעבירים תאי 5 (P5) לכלים עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ ומגדלים את התאים במהלך הלילה.
6. סומנו את המיטוכונדריה המבודדת עם צבע אדום פלואורסצנטי ייחודי למיטוכונדריה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות ושטפו את המיטוכונדריה עם PBS להסרת צבע לא קשור.
7. הוסיפו מיטוכונדריה מסומנת בצבע פלואורסצנטי אדום (20 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי לכל צלחת) לתאים ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
8. צבעו את התאים עם גלאי אקטין פלואורסצנטי למשך 30 דקות כדי להמחיש את שלד האקטין ולצבוע גרעיני נגד צבע גרעיני פלואורסצנטי.
   הערה: יש לשלוט בזהירות בריכוז הסרום במהלך הדגירה המשותפת, מכיוון שסרום מופרז עלול להפחית את יעילות קליטת המיטוכונדריה. המיטוכונדריה שבשלב זה היא טרייה.

11. מדידת תפקוד נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

1. הכנת כלי נגינה
   1. נקה את תאי הנשימה, תא האלקטרודות והפקקים.
   2. הניחו מוט ערבוב מגנטי בכל תא ווודאו את שלמות ממברנת אלקטרודת החמצן.
2. כיול מכשירים
   1. הוסיפו 2.1 מ"ל של בופר נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05, pH 7.10) לכל תא נשימה וודאו שאין בועות אוויר.
   2. איזון את מערכת הספירומטריה ברזולוציה גבוהה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וביצוע כיול אוויר יומי לאחר ייצוב קו הבסיס של החמצן.
      הערה: הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתא הנשימה, שכן הן מפריעות לאותות אלקטרודות החמצן ופוגעות באיכות הנתונים. המיטוכונדריה שבשלב זה היא טרייה.
3. עומס דגימות ואיזון
   1. הוסיפו מיטוכונדריה מבודדת טרייה המכילה כ-30 מיקרוגרם חלבון לתוך תא הנשימה ואוטם את החדר.
   2. לאזן את התא למשך 5-8 דקות ולרשום צריכת חמצן בסיסית.
      הערה: שמרו על המיטוכונדריה על קרח ובצעו מדידות נשימה מיד לאחר הבידוד כדי לשמור על פעילות.
4. פרוטוקול SUIT
   1. הוסיפו 5 מיקרוליטר פירובט (2 מ'), 10 מיקרוליטר גלוטמט (2 מ'), ו-10 מיקרוליטר מאלט (400 מ״מ) ברצף. ייצוב את התגובה למשך 5 דקות ותעדים נשימה של דליפת CI.
   2. הוסף 10 מיקרוליטר ADP (500 מ"מ) כדי לגרום לזרחון חמצוני ולרשום נשימת CI OXPHOS. הוסף 10 מיקרוליטר מגנזיום כלוריד (0.3 מ').
   3. הוסף 20 מיקרוליטר סוקסינאט (1 מ') ורשום את נשימת CI+CII OXPHOS לאחר הייצוב.
   4. הוסף 2 מיקרוליטר מעכב ATP סינתאז (0.01 מ״מ) ורשם את דליפת הפרוטון.
   5. הוסיפו CCCP (1 מ״מ) בהדרגה בשלוש הוספות של 2 מיקרוליטר במרווחים של 2 דקות עד שצריכת החמצן מגיעה לפלטו. רשם קיבולת מקסימלית של מערכת העברת אלקטרונים.
   6. הוסף 1 מיקרוליטר רוטנון (1 מ״מ) כדי לעכב פעילות מורכבת I.
   7. הוסף 1 מיקרוליטר אנטימיצין A (5 מ"מ) כדי לעכב פעילות קומפלקס III ולתעד צריכת חמצן שאריתית.
   8. הוסף 5 מיקרוליטר אסקורבט (800 מ"מ) ו-5 מיקרוליטר n,n,n',n'-טטרמתיל-p-פנילנדיאמין (200 מ"מ). תיעד פעילות הנשימה המורכבת המקסימלית של ה-IV לאחר הייצוב.
      הערה: יש לבצע Aliquot את כל החומרים לפני ההקפאה כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. הוסף CCCP בהדרגה, שכן ניתוק יתר מעכב את נשימת המיטוכונדריה.
5. ניתוח נתונים
   1. השגת פרמטרי נשימה מיטוכונדריאליים, כולל CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET ו-CIV, באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.
   2. חשב את יחס הבקרה הנשימתית (RCR; נשימה במצב 3/במצב 4) ויכולת ייצור ATP. שמור את כל הערכים לשלושה מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. התוכנה ששימשה לניתוח נתונים הייתה Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

תוצאות

סקירה סכמטית של תהליך הבידוד והטיהור של המיטוכונדריאלים מוצגת באיור 1. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורה של 4°C לשמירה על שלמות המיטוכונדריה ופעילותה התפקודית. רקמת שריר שלד מבודדת טרייה טוחנה ועוכלה עם טריפסין כדי להקל על פירוק הרקמות, ולאחר מכן הומוגנית בבופר בידוד איזוטוני באמצעות הומוגניזר זכוכית. לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה דיפרנציאלית להפרדת מיטוכונדריה מפסולת רקמה ומזהמים ציטוזוליים. הצנטריפוגה הראשונית ב-1,000 × גרם הסירה גרעינים ופסולת גדולה, בעוד שהצנטריפוגה...

דיון

השתלת מיטוכונדריה היא אסטרטגיה מתפתחת בטיפול תאים ורפואה רגנרטיבית, המשחזרת את התפקוד הפיזיולוגי בתאים עם מטבוליזם אנרגיה פגוע באמצעות אספקת מיטוכונדריה שלמה תפקודית. בנוסף לוויסות חילוף החומרים של אנרגיה תאית, טכניקה זו יכולה לווסת תהליכים ביולוגיים מרכזיים כגון אפופטוזיס ולחץ חמצוני, ובכך לספק הזדמנויות טיפוליות חדשות למגוון מחלות 4,17,18,19. עם זאת, התרגום ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	אפיון מיטוכונדריה
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	הפחתת דהייה של צבעים פלואורסצנטיים
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	מבחן ריכוז חלבון
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	נוגדן Beta-actin שימש לגילוי טוהר המיטוכונדריה המבודדת
BSA	Sigma	A6003	במהלך הבידוד, הוא קושר חומצות שומן חופשיות כדי להגן על פעילות המיטוכונדריה.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	צנטריפוגה ב-4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	להוציא חיבור חמצוני של הפוספורילציה המיטוכונדריאלית ולגרום לדליפת פרוטונים מירבית
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	תצפית על צביעת אימונופלואורסצנטית
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	אפיון מיטוכונדריה
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	לצביעת נגדית גרעינית
D-mannitol	Solarbio	IM00402	לשמירה על איזון אוסמוטי ולמניעת נפיחות מיטוכונדריאלית במהלך הבידוד
EGTA	Sigma	E4378	נמצא בשימוש נפוץ במאגרי בידוד מיטוכונדריאליים כדי להגן על תפקוד המיטוכונדריה על ידי קישור ספציפי ל-Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	גידול תאים L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	משמש לאחיזה, החזקה והרמת רקמות
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	משמש להומוגניזציה של רקמות ולבידוד מיטוכונדריה
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	זה קובע במהירות ומייצב את המבנה האולטרה-סלולרי של התא על ידי צלב חלבונים, ומונע אוטוליזה כדי לשמר את המורפולוגיה הטבעית של האורגנלים.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	מספק סביבת pH יציבה.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	גידול תאים L929
JC-1	Solarbio	M8650	גילוי שינויים בפוטנציאל הממברנה של מיטוכונדריה מטוהרים.
L929 cell line	Procell	CL-0137	לבדיקת סוף-פאגוציטוזה מיטוכונדרית
Lead citrate	Sigma	15326	כדי לצבוע חתכים דקים לתצפית מבנה תת-סלולרי דק.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	גידול תאים L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	כמרכיב של מאגר העברה, הוא משמש להסרת SDS ולהקלת העברת חלבונים מהג'ל לממברנה מוצקה.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	מדידת ספיגת JC-1-סטייני מיטוכונדריה
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	גילוי פוטנציאל קרום מיטוכונדריה בשרירים שלד
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	ערכות להפקה על בסיס צנטריפוגציה דיפרנציאלית
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	לשימור מיטוכונדריה
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	אפיון מיטוכונדריה
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	כמאגר בהכנת תמיסה
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 מכוון ל-IgG עכבר (H+L) ב-Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 מכוון ל-IgG ארנב (H+L) ב-ELISA ו-Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	הוא משמש בעיקר כחומר חסימה כדי להפחית את אות הרקע על ידי כיבוש אתרי קישור לא ספציפיים על הממברנה.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	קביעת תפקוד נשימתי מיטוכונדריאלי ומטבוליזם חמצן.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	או פוסט-פיקסציה לשמירת שומנים ושיפור ניגודיות הממברנה בדגימות TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	ניקוי רקמת שריר
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	גידול תאים L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	תיוג ציטו-שלד F-actin לתמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות
Polyvinyl