מאמר שיטה

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

DOI:

10.3791/71732

⸱

10 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 4School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA לא מקודד ארוך טווח (lncRNAs) הפכו לווסתים חשובים של תהליכים ביולוגיים מגוונים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שמאחורי תפקודי רוב ה-lncRNA עדיין אינם מובנים היטב. זיהוי חלבונים אינטראקטיביים, במיוחד חלבונים קושרים ל-RNA (RBPs), הוא אסטרטגיה מרכזית להבהרת תפקוד ה-lncRNA. מבין הגישות הזמינות, זיהוי מקיף של חלבוני קישור RNA (ChIRP) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה משמש באופן נרחב בשל עיצוב הגלאי הפשוט ותהליך העבודה הפשוט. ChIRP קונבנציונלי מסתמך על קישוריות פרפורמלדהיד (PFA), שלוכדת הן מגעים ישירים עם חלבון RNA והן אינטראקציות עקיפות המתווכות על ידי גורמי גישור. לעומת זאת, קישור צולב UV בשילוב עם תנאי שטיפה מחמירים שומר באופן מועדף אינטראקציות ישירות בין RNA לחלבון. באמצעות ה-lncRNA Tug1 כמודל, הושוו קישור צולב UV ו-PFA במסגרת ChIRP בתאים מתורבתים, מה שהוכיח כי ChIRP מבוסס UV מעשיר אינטראקציות ישירות בין lncRNA. תהליך עבודה זה מבוסס UV הורחב לאחר מכן לאשכי עכברים, שבו רקמות פורקו לתלויות חד-תאיות לפני קישור ה-UV, מה שאפשר זיהוי חלבוני קישור Tug1 בהקשר רקמתי טבעי. השוואה עם אינטראקטומים שמקורם בקו התאים חשפו אינטראקטורים משותפים וספציפיים לרקמה. שתי אינטראקציות ישירות משותפות אומתו באופן עצמאי על ידי שיפור אימונופרפסיפיציה (eCLIP). גישה זו מבוססת UV של ChIRP נקראת cPDiRT (לכידת חלבונים האינטראקציה הישירה עם מטרה RNA). ביחד, cPDiRT מאפשר זיהוי חלבונים הקשורים ל-lncRNA הן בתאים מתורבתים והן ברקמות מקומיות. השילוב של דיסוציאציה של רקמות וקישור צולב UV מספק אסטרטגיה רחבה ליישום לחקר אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון במערכות איברים מגוונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים טרנסקריפטומיים בעלי תפוקה גבוהה לאחרונה חשפו אלפי RNA לא מקודדים ארוכים (lncRNAs) המשתתפים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, החל מארגון כרומטין ועד איתות תאיים 1,2. למרות הביטוי הרחב וחשיבותם התפקודית, המנגנונים המולקולריים של רוב ה-lncRNA נותרו לא מוגדרים היטב. מכשול מרכזי הוא זיהוי שותפי החלבון הפיזיים שלהם, במיוחד חלבוני קישור RNA (RBPs)3,4,5.

השיטות הנוכחיות הממוקדות ב-RNA מתבססות בעיקר על קישור משולב כימי, אשר לוכד אינטראקציות ישירות ועקיפות בין RNA לחלבון. כתוצאה מכך, גישות אלו מתאימות יותר למיפוי אינטרקטומים גלובלי מאשר לזיהוי מגעים ישירים אמיתיים6. זיהוי מקיף של חלבוני קישור ל-RNA ואחריו ספקטרומטריית מסה (ChIRP-MS) הוא טכניקה נפוצה למיפוי אינטראקציות בין lncRNA-RBP בשל עיצוב הגשוש הפשוט שלה וזרימת העבודה היעילה 7,8. ChIRP-MS קונבנציונלי משתמש בקישוריות צולבת פאראפורמלדהיד (PFA), הלוכדת הן מגעים ישירים עם חלבון RNA והן אסוציאציות עקיפות המתווכות על ידי גורמי גישור 9,10.

לעומת זאת, קישור צולב UV ב-254 ננומטר מציע יתרון קריטי. הוא מקשר קוולנטית בין RNA לחלבונים רק כאשר הם נמצאים במגע קרוב לאפס (בדרך כלל <1 Å)11. תהליך זה ממיר קשרי מימן לקשרים קוולנטיים יציבים ומאפשר תנאי שטיפה מחמירים עם מלח גבוה שמסירים אינטראקטורים עקיפים שאינם קשורים קוולנטית. כתוצאה מכך, גישות מבוססות UV מספקות ספציפיות גבוהה יותר לאינטראקציות RNA ו-חלבון ישירות מאשר שיטות קישור משולב כימי12,13. עם זאת, גישות מבוססות UV עדיין לא מנוצלות מספיק במחקרי אינטראקטום lncRNA שמקורם ברקמות, בעיקר בשל חששות מיעילות הקישור החוצה והגבלת חדירת ה-UV.

כדי לחקור אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון בהקשר פיזיולוגי רלוונטי, נבחר ה-lncRNA Tug1 כמערכת מודל. Tug1 מהווה נקודת ייחוס אידיאלית לאימות תהליך אינטראקציה ישירה תואם רקמות בשל הפנוטיפ החמור שלו וההעשרה הגבוהה באשכים. אבלציה גנטית של Tug1 גורמת לעקרות גברית מלאה, פגיעה ביצירת תאי זרע ומורפולוגיית זרע לא תקינה14. בנוסף, Tug1 תומך בתפקוד תאי סרטולי ובשלמות מחסום האשכים בדיאטה עתירת שומן15. למרות הפנוטיפים המבוססים הללו, שותפי החלבון הישירים המתווכים את תפקוד Tug1 באשך—איבר המבטא מספר רב של RBP שזוהו לאחרונהב-16—נותרו לא ידועים. פער ידע זה משקף במידה רבה את העובדה שרוב שיטות מיפוי האינטראקציה בין lncRNA לחלבונים פותחו עבור מערכות תאים מתורבתות.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, מסגרת ChIRP שונתה על ידי החלפת קישור צולב PFA בקישור צולב UV כדי ללכוד חלבונים שמקשרים ישירות עם Tug1. האינטראקציות המועמדות אומתו באופן עצמאי על ידי הגברת אימונופרציפיטציה של קישור צולב ואחריה ריצוף עמוק (eCLIP-seq)17. תהליך העבודה הורחב גם ליישומי רקמות על ידי פירוק רקמת אשך עכבר טרייה לתאים בודדים לפני קישור צולב UV. גישה אופטימלית זו נקראה cPDiRT (לכידת חלבונים הפועלים ישירות עם יעד RNA).

יישום cPDiRT ל-Tug1 באשך העכבר מאפשר מיפוי אינטראקציה ישירה בהקשר רקמתי מקומי. ניסויים מקבילים בתאים מתורבתים סיפקו השוואה צמודה בין פרופילי אינטראקציה מבוססי PFA ל-UV. בשילוב עם אימות eCLIP עצמאי, גישה זו יצרה סט של שותפים מולקולריים בעלי ביטחון גבוה שעשויים לתרום לתפקוד Tug1 במהלך יצירת הזרע. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לכידת חלבונים שמקיימים אינטראקציה ישירה עם lncRNA המטרה הן בתאים מתרבתים והן ברקמות מקומיות. על ידי הגדרת האינטראקטום הישיר של Tug1 באשכים, שיטה זו מקדמת מחקרים מכניים של lncRNA חיוני לפוריות ומספקת פלטפורמה כללית לחקר אינטראקציות בין lncRNA לחלבון ברבייה וברקמות מורכבות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל התמיסות הוכנו באמצעות מים אולטרה-טהורים ללא נוקלאז, ללא פרוטאז, וחומרים מגובים. כל החומרים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה (מס' אישור: IACUC-1812003-4) ובוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (המועצה הלאומית למחקר, מהדורה 8). לשמור על עכברים זכרים C57BL/6 (בני 4 שבועות) במחזור של 12 שעות אור/12 שעות חושך עם גישה חופשית למזון ולמים. מזער סבל בעלי חיים על ידי שימוש בבעלי החיים המועטים ביותר הדרושים להשגת מובהקות סטטיסטית. המתת חסד לעכברים באמצעות שאיפת CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים מאושרים.

1. הכינו בופרים

  1. הכינו בופר לליסיס תאים
    1. הכינו בופר פירוק תאים המכיל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.0), 10 מ"מ EDTA, ו-1% SDS.
    2. מיד לפני השימוש, הוסיפו 1 mM PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז ומעכב RNase ייעודי.
      אזהרה: SDS הוא מגרה בעור ובעיניים. הימנע משאיפת אבק או אירוסולים. PMSF רעיל מאוד, פועל כמעכב כולינאסטראז, ואינו יציב בתמיסה מימית. הכינו PMSF מיד לפני השימוש. לבש כפפות ומשקפי בטיחות בעת טיפול בחומרים אלו. לטפל ב-PMSF במכסה אדים כימימי.
  2. הכנת בופר היברידיזציה
    1. הכינו בופר היברידיזציה המכיל 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, ו-15% פורמיד.
    2. מיד לפני השימוש, הוסיפו 1 mM PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז ומעכב RNase ייעודי.
      הערה: אחסן פורמיד ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מאור.
      אזהרה: פורמיד הוא טרטוגן וסכנת רבייה. לטפל בפורמיד במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות. הימנעו משאימה ומגע עור.
  3. הכנת בופר שטיפה
    1. הכינו בופר שטיפה המכיל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.0), 1 מ' NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS ו-0.5% נתרן דאוקסיכולאט.
    2. הגן על בופר הכביסה מאור בזמן האחסון.
  4. הכינו בופר לחראנאאז K (PK)
    1. הכינו בופר PK המכיל 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, ו-0.5% SDS.
    2. הוסף פרוטאינאז K לריכוז סופי של 5% מיד לפני השימוש.

2. תכנון והכנת גשושים

  1. גשושי אנטיסנס מעצבים
    1. עיצוב גשושי אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס באמצעות מעצב הגשוש המקוון הזמיןב-singlemoleculefish.com 18.
  2. השגת גשושים ביוטיניליים
    1. הזמינו גשושי DNA אנטיסנס המכילים שינוי 3'-BiotinTEG.
  3. הכינו את בריכת הגשוש
    1. מדלל כל גלאי בנפרד ל-100 מיקרומטר.
    2. ערבב נפחים שווים של כל הגשושים כדי ליצור מאגר גשושים. לשמור על ריכוז אוליגונוקלאוטידים משולב סופי של 100 מיקרומון.
    3. אחסן את בריכת הגשוש בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: פרמטרי עיצוב הגשוש המומלצים הם כדלקמן: (i) פרוב אחד לכל 100 bp של RNA יעד, (ii) תכולת GC יעד של 45%, (iii) אורך גלאי של 20 nt, ו-(iv) מרווח של 60–80 nt בין הגשושים.
      הערה: אם ה-RNA חורג מגבלת הגודל שהתקבל על ידי מתכנן הגשוש, יש לחלק את הרצף לקטעים קטנים יותר לפני התכנון. החריגו אזורים ואזורים חוזרים עם הומולוגיית רצף נרחבת.

3. ביצוע איסוף תאים, פירוק רקמות וקישוריות צולבות UV

  1. הכינו בקרות ללא UV
    1. הכינו דגימות ביקורת במקביל לדגימות ניסיוניות.
    2. השמיטו את שלב הקישור הקרסולי UV מדגימות בקרה.
    3. בצע את כל ההליכים הבאים, כולל סוניקציה, משיכת RNA-חלבון, חילוץ RNA והפקת חלבון, באופן זהה לשתי הקבוצות.
      הערה: השתמש בבקרת ללא UV כדי להבחין בין אינטראקציות RNA-חלבון תלויות UV לבין קישור רקע לא ספציפי.
  2. איסוף תאים וביצוע קישור צולב UV
    1. תאים מתורבתים בשטיפה
      1. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את מדיום התרבית שנותרו.
    2. תאי קישור צולב
      1. פזר 3 מ"ל PBS באופן שווה על צלחת תרבית בגודל 15 ס"מ.
      2. הקרנת תאים ב-Crosslinker UV של 254 ננומטר במינון של 4000 mJ/cm2.
    3. איסוף תאים מקושרים
      1. אסוף תאים ב-PBS לאחר קישור צולב.
      2. צנטריפוגה את המתלים וזרוק את הסופרנטנט.
      3. שקלו את הכדור ואשרו מסה מינימלית של 500 מ"ג לכל דגימה.
  3. נתק רקמת אשכים וביצוע קישור צולב UV
    1. הכינו את האשכים
      1. אשכים מפורקים.
      2. שטוף את הטישו פעמיים עם DMEM.
    2. בצע עיכול קולגנאז
      1. לדוג רקמה ב-DMEM המכילה 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז IV בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–15 דקות.
      2. המשך העיכול עד שצינורות זמניפריים משתחררים.
        הערה: אין לעלות על 15 דקות עיכול.
    3. שטפו את הצינורות המיניפריים
      1. צנטריפוגה את המתלים ב-1000 × גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
      2. הסר את הסופרנטנט.
      3. שטפו את הכדור עם 5–10 מ"ל DMEM.
      4. צנטריפוגה שוב באותם תנאים.
    4. בצע עיכול טריפסין
      1. החזירו את הכדור ל-0.25% טריפסין המכיל 1 מ"ג/מ"ל DNase I.
      2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–15 דקות.
        הערה: אין לעלות על 15 דקות עיכול.
    5. עצור את העיכול האנזימטי
      1. הוסיפו כמות שווה של DMEM בתוספת 10% FBS.
    6. יצירת תלייה חד-תאית
      1. מסנן את המתלים דרך מסננת תא 70 מיקרון.
    7. תאי שטיפה
      1. תאי צנטריפוגה ב-2000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. זרוק את הסופרנטנט.
      3. שטפו את הכדור עם 5–10 מ"ל PBS.
      4. צנטריפוגה שוב באותם תנאים.
    8. תאי אשכים משולבים
      1. להחזיר את המתלה החד-תאי ב-PBS.
      2. פזר את התלייה באופן שווה על צלחת תרבית בגודל 15 ס"מ.
      3. הקרנת תאים ב-Crosslinker UV של 254 ננומטר במינון של 4000 mJ/cm2.
    9. איסוף תאים מקושרים
      1. לבקרות ללא UV, הימנעו מקרינה.
      2. לאסוף תאים ב-PBS.
      3. צנטריפוגה את המתלים וזרוק את הסופרנטנט.
      4. שקלו את הכדור ואשרו מסה מינימלית של 500 מ"ג לכל דגימה.
        הערה: מספר העכברים הנדרש לקבלת כ-500 מ"ג של כדורי תאים תלוי בגיל ובתפוקת הרקמות. בערך 10–12 עכברים בני ארבעה שבועות שימשו במחקר זה.

4. לבצע סוניקציה

  1. הכינו ליזאטים
    1. החזירו כדורי תא בבופר ליליזה ביחס של 100 מ"ג כדור ל-1 מ"ל בופר.
    2. ערבבו היטב כדי לקבל תלייה הומוגנית.
  2. דגימות סוניקייט
    1. סוניקט ליזאט באמצעות סוניקטור אמבט מים או אולטרסוניקטור ממוקד.
    2. המשך בקול עד שהליזאט הופך לברור לעין.
      הערה: אימות פיצול DNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. המשיכו בסוניקציה עד שרוב חלקי ה-DNA נעים בין 1 קילובארט ל-2 קילוב.

5. ביצוע משיכת RNA-חלבון כלפי מטה

  1. איסוף דגימות קלט
    1. הסר אליקואטים של ליזאט עבור בקרות קלט.
    2. שמרו כ-10 מיקרוליטר לניתוח RNA ו-10 מיקרוליטר לניתוח חלבונים.
    3. שמרו על דגימות קלט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הליכי ההיברידיזציה והשטיפה.
  2. ליזאטים פרקליר
    1. הוסיפו 30 מיקרול של חרוזי מגנטיים שטופו מראש לכל דגימה.
    2. דגרו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב עדין בתנור היברידיזציה.
      הערה: שטוף חרוזים מגנטיים לפני השימוש. הנח אליקווטים חרוזים על מעמד מגנטי למשך דקה אחת או עד שהתמיסה מתבהרת. הסר את תמיסת האחסון לחלוטין. שטפו חרוזים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של בופר ליזיס תאים.
  3. הסר חרוזי ניקוי מוקדם
    1. הנח דגימות על מעמד מגנטי.
    2. העבר את הסופרנטנט לצינור טרי.
    3. חזור על ההעברה פעם אחת כדי להבטיח הסרה מלאה של החרוזים שנותרו.
  4. היברידיזציה של גשושים
    1. הוסף שני נפחים של בופר היברידיזציה לכל דגימה.
    2. הוסף גלאים ביחס של 1 מיקרוליטר של מלאי גלאי 100 מיקרומום לכל 1 מ"ל ליזאט (טבלה משלימה 1).
  5. תגובות הכלאה בדגירה
    1. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה על קצה למשך 12–16 שעות בתנור היברידיזציה.
  6. הכינו חרוזי לכידה
    1. שטוף 100 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים שלוש פעמים עם בופר ליזיס תאים מיד לפני סיום ההיברידיזציה.
    2. הסר את כל הבופר שנותר אחרי הכביסה הסופית.
  7. קומפלקסים קשורים ללכידת פרוב
    1. תגובות היברידיזציה בצנטריפוגות לזמן קצר.
    2. החזירו את החרוזים השטופים ב-1 מ"ל של דגימה היברידית.
  8. קומפלקסים של קישור לחרוזים
    1. החזיר את מתלה החרוזים לצינור המקורי.
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב למשך 30–40 דקות.
  9. חרוזים לשחזור
    1. דגימות צנטריפוגות קצרות.
    2. הניחו צינורות על מעמד מגנטי למשך 1–2 דקות או עד שהתמיסה מתבהרת.
    3. זרוק את הסופרנטנט.
    4. הסר נוזל שנותר באמצעות קצה פיפטה.
      הערה: הימנע מהפרעה לכדור החרוז המגנטי בזמן הסרת נוזלים.
  10. קומפלקסים שנתפסו על ידי ווש
    1. הוסף 1 מ"ל של בופר כביסה.
    2. שטפו חרוזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף למשך 5 דקות.
    3. חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים.
      הערה: בופר השטיפה מכיל 1 M NaCl, אשר מפריע לאינטראקציות לא קוולנטיות-חלבון-חלבון וחלבון-RNA תוך שמירה על קישורי הצלב המושרים על ידי UV קוולנטי. תנאים מחמירים אלה מסירים אינטראקטורים עקיפים ורקע לא ספציפי, ובכך מעשירים את שותפי החלבון הישירים19.
  11. חומר רזרבי לניתוח RNA
    1. העבר 1%–10% מהחרוזים השטופים לצינור חדש לניתוח RNA.
    2. השתמשו בשאר החרוזים מיד להפקת חלבון או אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: עצרו את הפרוטוקול כאן אם צריך. אחסן דגימות חרוזים בטמפרטורה של מינוס 80°C עד להפקת חלבון.
  12. חלבוני אלוט
    1. הוסף בופר דגימה SDS לחרוזים.
    2. רתיחו דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לשחרר חלבונים ולהפיכת קישורים צולבים.
    3. המשך לניתוח ספקטרומטריית מסה.

6. חילוץ RNA

  1. עיכול חלבונים
    1. החזירו דגימות RNA הקשורות ל-100 מיקרו ליטר של בופר PK.
    2. כוונן דגימות קלט RNA לנפח סופי של 100 מיקרוליטר באמצעות buffer PK.
  2. דגירה עם פרוטנאאז K
    1. דגמו דגימות בטמפרטורה של 50°C למשך 45 דקות עם ערבוב רציף.
  3. מנטרל פרוטנאז K
    1. דגימות חום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. הוסף ריאגנט TRIzol
    1. הוסף 500 מיקרוליטר של תגובת טריזול לכל דגימה.
    2. מערבולת ביסודיות.
    3. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: תגובת טריזול מכילה פנול וגואנידין תיוציאנט. לטפל במגיב במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות. הימנעו משאימה ומגע עור. אם יש מגע עור, יש לשטוף מיד עם סבון ומים.
  5. ביצוע הפרדת פאזה
    1. הוסיפו 100 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה.
    2. מערבולת ביסודיות.
    3. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. שחזור הפאזה המימית
    1. דגימות צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות.
    2. העבר את השלב המימי העליון לצינור טרי.
  7. קישור RNA לעמודי טיהור
    1. הוסף נפח שווה של 100% אתנול לשלב המימי.
    2. ערבב היטב.
    3. העמס דגימות על עמודות טיהור RNA.
  8. טיהור RNA
    1. בצע ניקוי RNA לפי הוראות היצרן.
    2. RNA אלוט ב-30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
  9. אימות העשרת RNA באמצעות qRT-PCR
    1. השתמשו ב-1 מיקרוליטר RNA מושלף בכל תגובה ל-PCR שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR).
    2. העריך את העשרת ה-RNA המטרה ביחס לביקורת.

7. ביצוע ניתוח LC-MS/MS

  1. הפרדת חלבונים לפי SDS-PAGE
    1. מערבבים חלבונים שהתקבלו בשלב 5.12 עם 4× בופר דגימה של LDS.
    2. הפרדו חלבונים על ג'ל ביס-טריס של 4%–12%.
    3. צבעי את הג'ל עם ערכת צביעה בכסף.
    4. להסיר את כל מסלול החלבון כרצועה אחת.
  2. חלקי ג'ל למס
    1. הסר את רצועת החלבון באמצעות סכין מנתח נקי.
    2. מזער את כמות הג'ל העודף.
    3. חתוך את הג'ל לכ-1 מ"מ3 חתיכות.
    4. העבר חתיכות ג'ל לצינור של 0.5 מ"ל.
  3. חלקי ג'ל להסרת צבע
    1. הוסף 100 מיקרו ליטר של תמיסת הסרת צבעים.
    2. מערבולת ל-10 דקות.
    3. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך דקה אחת.
    4. הסר את הסופרנטנט.
    5. חזור על תהליך ההסרה עד שחתיכות הג'ל הופכות לשקופות.
  4. הפחתת חלבונים
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הפחתה.
    2. דגרו בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. דגימות קרות לטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה לזמן קצר והסר את הסופרנטנט.
  5. חלבוני אלקילט
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת אלקילציה.
    2. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך.
    3. הסר את הסופרנטנט.
    4. שטפו חתיכות ג'ל עם 100 מיקרוליטר של בופר עיכול למשך 5 דקות.
  6. עיכול חלבונים
    1. הוסף מספיק תמיסת טריפסין כדי לכסות לחלוטין את חתיכות הג'ל.
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות.
  7. תמצית פפטידים
    1. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת חילוץ.
    2. סוניקייט ל-15 דקות או וורטקס ל-30 דקות.
    3. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך דקה אחת.
    4. העבר את הסופרנטנט לצינור טרי.
    5. חזור על הליך ההוצאה פעמיים.
    6. אסוף את כל התמציות.
    7. תמציות יבשות מאוחסנות בריכוז ואקום למשך כ-1 שעה.
  8. ניקוי פפטידים באמצעות StageTip
    1. החזירו פפטידים מיובשים ל-20 מיקרוליטר של חומצה פורמית (FA) של 0.1%.
    2. טעין דגימות על C18 StageTip.
    3. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות.
    4. שטוף את ה-StageTip עם 20 מיקרוליטר של 0.1% FA.
    5. פפטידים אלוטים עם 20 מיקרוליטר של 60% אצטוניטריל/0.1% FA לתוך בקבוקון LC-MS.
    6. ייבשו את האלואוט.
    7. השעתי מחדש פפטידים ב-10 מיקרוליטר של 0.1% FA.
      הערה: עצרו את הפרוטוקול כאן אם צריך. אחסן פפטידים מטוהרים בטמפרטורה של -80°C לפני ניתוח LC-MS/MS.
  9. רכישת נתוני LC-MS/MS
    1. שחזור פפטידים בחומצה פורמית של 0.1%.
    2. פפטידים נפרדים בעמוד אנליטי של 75 מיקרון × 250 מ"מ C18 בקצב זרימה של 300 ננוליטר לדקה.
    3. מרח את גרדיאנט הממס B הבא (0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל):
      2%–25% B מעל 0–40 דקות
      25%–40% B במשך 40–48 דקות
      40%–99% B לאורך 50–57 דקות
      החזק על 99% B למשך 3 דקות
    4. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב רכישת נתונים תלויה.
    5. רכוש ספקטרום MS בסריקה מלאה בטווח m/z של 350–1200 ברזולוציה של 70,000.
    6. רכוש חמש עשרה סריקות דיסוציאציה התנגשויות באנרגיה גבוהה (HCD) MS/MS ברזולוציה של 17,500.
    7. הקליטו מיקרוסקאן אחד בכל סריקה.
    8. הגדר את ההחרגה הדינמית ל-30 שניות.
  10. נתוני ספקטרומטריית מסה תהליכית
    1. עבד נתונים גולמיים באמצעות MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. חפש ספקטרום מול רצפי חלבון עכבר שהורדו מ-UniProt.
    3. ציין טריפסין כאנזים העיכול.
    4. אפשר מקסימום שני חיתוך שהחמצו.
    5. יש לציין חמצון מתיונין כשינוי משתנה.
    6. יש לציין קרבאמידומתילציה ציסטאין כשינוי קבוע.
    7. קבע את סבילות המסה של קדם-מקור וקטע ל-15 ppm ו-20 ppm, בהתאמה.
    8. לשלוט בשיעור הגילוי השגוי של 1% הן ברמות הפפטיד והן ברמות החלבון.
    9. הערכת שפע חלבונים באמצעות כימות ללא תוויות מבוסס iBAQ.

8. ביצוע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים

  1. ניתוח העשרה פונקציונלית
    1. בצע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) באמצעות חבילת clusterProfiler R (v4.6.0).
    2. השתמש במסד הנתונים GO (v2024-09-20) כמקור להערות ייחוס.
    3. החלו תיקון Benjamini-Hochberg לבדיקות מרובות.
    4. הגדר מובהקות סטטיסטית כערך P מותאם (FDR) < 0.05.

9. ביצוע אימות eCLIP-seq

  1. הכינו דגימות eCLIP
    1. בצע חיסון חירוי משופר (eCLIP) כפי שתואר קודם17.
    2. הכינו דגימות תאים משולבות ב-UV לאימונופרציפיטציה של PABPC1 ו-CCT3.
    3. דגימות Lyse באמצעות מאגר ליזיס eCLIP.
  2. קומפלקסים של חלבוני RNA אימונופרסיפיט
    1. הוסף 10 מיקרוגרם נוגדן לכל דגימה.
    2. לכידת קומפלקסים של חלבוני RNA על חרוזים מגנטיים.
    3. אסוף דגימות קלט לפני אימונופרציפיטציה.
  3. הכנת ספריות RNA
    1. RNA הקשורים לחלבון דפוספורילאט.
    2. חבר מתאם RNA של 3 רגל כדי להחזיר RNA.
    3. שטוף דגימות עם אימונופרציפיטציה והזנה בתנאים מחמירים.
    4. קומפלקסים של אלוט על ידי הרתיחת החרוזים.
    5. רזולור דגימות על ג'ל גרדיאנט של 4%–12% ביס-טריס.
    6. העבר קומפלקסים מופרדים לממברנת ניטרוצלולוז.
  4. שחזור RNA
    1. להסיר אזור ממברנה מותאם לגודל.
    2. לעכל חלבונים באמצעות אוריאה ופרוטונאז K.
    3. לשחזר RNA מהממברנה.
  5. יצירת ספריות רצף
    1. תמלול הפוך שחזר RNA ל-cDNA.
    2. לטהר cDNA באמצעות אקסונוקלאז I ותערובת פוספטאז אלקליני של שרימפס.
    3. חבר מתאם DNA לקצה 3' של ה-cDNA באמצעות ליגז RNA של T4.
    4. הגברת ספריות באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה.
    5. ספריות מוגברות נפרדות על ג'ל אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 3%.
    6. לטהר ספריות לפי גודל נבחר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל.
    7. ספריות רצף על פלטפורמת Illumina.
  6. ניתוח נתוני eCLIP-seq
    1. נתח נתוני רצף באמצעות צינור ENCODE eCLIP20.
    2. מתאמי גימור ודימרים של מתאם 3' משתמשים ב-cutadapt (v1.14).
    3. יישר קריאות לרכיבי UCSC חוזרים באמצעות STAR (v2.7.6a).
    4. הסר מיפוי קריאות לאלמנטים חוזרים.
    5. יישר את הקריאות שנותרו לגנום ההתייחסות של mm10 (GENCODE vM23).
    6. הסר כפילויות PCR.
    7. זהה אתרי קישור מועשרים באמצעות CLIPPER.
    8. הגדר שיאים משמעותיים כאלה עם העשרת קיפול ≥ 8 ו-P מותאם ≤ 0.001.
    9. זיהוי שיאים ניתנים לשחזור באמצעות סף שיעור גילוי בלתי שכפול (IDR) של 0.01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לזהות חלבוני קישור ל-Tug1, שולב קישור צולב UV בתהליך העבודה של ChIRP, ויצר שיטה בשם cPDiRT (איור 1). ChIRP קונבנציונלי בוצע לראשונה בתאי GC2 להעשיר חלבונים האינטראקטיביים עם Tug1 (איור 2A, B). ניתוח ספקטרומטריית מסה זיהה יותר מ-190 חלבונים מועשרים יחסית לביקורת שלילית (איור 2C; טבלה משלימה 2). לעומת זאת, cPDiRT-MS שבוצע במינון UV אופטימלי של 40...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPDiRT פותח כפרוטוקול מבוסס ChIRP מותאם שמחליף קישור צולב פרפורמלדהיד (PFA) בקישור צולב UV כדי ללכוד באופן סלקטיבי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון. על ידי שילוב דיסוציאציה אנזימטית של רקמת אשכים טרייה לתאים בודדים עם קישור צולב UV, מיפוי אינטראקציה ישירה הורחב מקווי תאים מתורבתים לרקמות מקומיות. ניסויים מקבילים בתאים מתורבתים אפשרו השוואה צמודה בין גישות מבוססות PFA ל-UV, ואינטראקציות שמקורן ב-UV אומתו באופן עצמאי על ידי eCLIP-seq. תוצאות אלו מראות כי ניתן לשלב בהצלחה קישור צולב UV ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לצ'יאנגפנג ג'אנג (אוניברסיטת צ'ינגחואה) וצ'י צ'ו (מעבדת הווארד צ'אנג) על דיונים מועילים בנוגע לפרוטוקול המקורי של ChIRP. ק.ז. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170858) ומהמנהיג האקדמי המצטיין של תוכנית הכישרונות האוריינטליים של שנגחאי (BJKJ2025057). ל.י. נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82571836, 32070843 ו-82371617).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin-EDTA SolutionGibco25200056לשימוש בפירוק רקמות והכנת השעיה של תא יחיד
100% EthanolSigma-Aldrich459844לניקוי RNA
AffinityScript Reverse TranscriptaseAgilent600107לסינתזת eCLIP cDNA
Anti-CCT3 AntibodyAbcamAb225878נוגדן עבור eCLIP
Anti-PABPC1 AntibodyAbcamAb312314נוגדן עבור eCLIP 
ChloroformSigma-AldrichC2432לחילוץ RNA
Collagenase Type IVSigma-AldrichC5138לפירוק אנזימטי של רקמת האשכים
Dephosphorylation reagents (T4 PNK)New England BiolabsM0201Sלדה-פוספורילציה של RNA eCLIP
DMEM High Glucose MediumGibco11965092לתרבית תאים ולחיץ פירוק רקמות
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic BeadsThermo Fisher Scientific65001ללכידה של קומפלקסים של חלבון-RNA-גלאי ביוטין
DynaMag-15 MagnetThermo Fisher Scientific12301Dלהפרדת חרוזים מגנטיים
DynaMag-2 MagnetThermo Fisher Scientific12321Dלהפרדת חרוזים מגנטיים
EDTASigma-AldrichE9884לכליה של קטיונים דו-ערכיים בחיצי ליזה ושטיפה
Exonuclease INew England BiolabsM0293Sלטיהור eCLIP cDNA
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099141Cלהפסקת עיכול הטריפסין
FormamideThermo Fisher ScientificAM9342להכנת חיץ הכלאה
Hybridization OvenTUOHELF-Iלהכלאה של גלאי ולשטיפת חרוזים
Low-Melting-Temperature AgaroseSigma-AldrichA9414להפרדת גודל ספריית eCLIP
MinElute Gel Extraction KitQiagen28604להפרדת גודל ספריית eCLIP
miRNeasy Mini KitQiagen217004לטיהור RNA
NaClSigma-AldrichS7653להכנת חיץ שטיפה עם מלח גבוה
Nitrocellulose MembraneGE Healthcare / Amersham10600002להעברה של חלבון מערבי eCLIP
NP-40Thermo Fisher Scientific85125לדטרגנט בחיץ שטיפה
Nuclease- and protease-free waterThermo Fisher Scientific10977035להכנת פתרונות נטולי נקלאזות
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelThermo Fisher ScientificNP0322BOXלהפרדת גודל eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast GelsThermo Fisher ScientificNP0321BOXלהפרדת חלבונים ב-SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010023לשטיפת תאים ולהשעיה מחדש
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626מעכב פרוטאז סרין לחיץ ליזה תאי; מתווסף טרי לפני השימוש
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001מעכב פרוטאז רחב-ספקטרום לחיץ ליזה תאי; מתווסף טרי לפני השימוש
Proteinase KSigma-AldrichP4850לעיכול חלבונים בחילוץ RNA
qRT-PCR Master MixThermo Fisher Scientific11704044ל-RT-PCR כמותי לאישוש העשרת RNA
RNase/Protease-Free DNase I SolutionThermo Fisher ScientificEN0521לפירוק רקמות
RNeasy Mini KitQiagen74104לטיהור RNA
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0286להכנת דגימת חלבון
Shrimp Alkaline PhosphataseNew England BiolabsM0371Sלטיהור eCLIP cDNA
Silver Stain KitBeyotimeP00175להדמיה של חלבונים בג'לים SDS-PAGE
Sodium DeoxycholateSigma-AldrichD6750לדטרגנט בחיץ שטיפה
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771לליזה תאית ודנטורציה של חלבונים
Superase-in RNase InhibitorThermo Fisher ScientificAM2694מעכב RNase מיוחד; מתווסף טרי לפני השימוש
T4 RNA LigaseNew England BiolabsM0204לליגציה של מתאם eCLIP
Tris–HCl (pH 7.0)Sigma-AldrichT5941להכנת חיצי ליזה, הכלאה ושטיפה
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNלחילוץ RNA
Ultrasonic cell crusherATPIOATPIO-650Dלליזה תאית ושבירת DNA
Ultraviolet CrosslinkerAnalytik JenaUVP CL-1000לקישור צולב UV של אינטראקציות RNA-חלבון
ureaSigma-AldrichU5128לפירוק חלבון eCLIP על ממברנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mattick JS, et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(6):430-447.
  2. Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 2024;187(23):6451-6485.
  3. Ferrè F, Colantoni A, Helmer-Citterich M. Revealing protein-lncRNA interaction. Brief Bioinform. 2016;17(1):106-116.
  4. Yi W, Yan J. Decoding RNA-protein interactions: Methodological advances and emerging challenges. Adv Genet (Hoboken). 2025;6(2):2500011.
  5. Elguindy MM, Mendell JT. NORAD-induced PUMILIO phase separation is required for genome stability. Nature. 2021;595(7866):303-308.
  6. Gräwe C, Stelloo S, Van Hout FAH, Vermeulen M. RNA-centric methods: Toward the interactome of specific RNA transcripts. Trends Biotechnol. 2021;39(9):890-900.
  7. Chu C, Chang HY. ChIRP-MS: RNA-directed proteomic discovery. Methods Mol Biol. 2018;1861:37-45.
  8. Chu C, et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 2015;161(2):404-416.
  9. Suryo Rahmanto A, et al. K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution. Mol Cell. 2023;83(23):4272-4289.e10.
  10. Sun W, et al. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat Chem. 2023;15(1):21-32.
  11. Esteban-Serna S, McCaughan H, Granneman S. Advantages and limitations of UV cross-linking analysis of protein-RNA interactomes in microbes. Mol Microbiol. 2023;120(4):477-489.
  12. Welp LM, et al. Chemical crosslinking extends and complements UV crosslinking in analysis of RNA/DNA nucleic acid-protein interaction sites by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2025;53(15).
  13. McHugh CA, Guttman M. RAP-MS: A method to identify proteins that interact directly with a specific RNA molecule in cells. Methods Mol Biol. 2018;1649:473-488.
  14. Lewandowski JP, et al. The Tug1 lncRNA locus is essential for male fertility. Genome Biol. 2020;21(1):237.
  15. Wang S, et al. LncRNA Tug1 maintains blood-testis barrier integrity by modulating ccl2 expression in high-fat diet mice. Cell Mol Life Sci. 2022;79(2):114.
  16. Li Y, et al. The landscape of RNA binding proteins in mammalian spermatogenesis. Science. 2024;386(6720).
  17. Xu Q, et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J Vis Exp. 2019;(147):59681. 
  18. Raj A, Van Den Bogaard P, Rifkin SA, Van Oudenaarden A, Tyagi S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 2008;5(10):877-879.
  19. Urdaneta EC, et al. Purification of cross-linked RNA-protein complexes by phenol-toluol extraction. Nat Commun. 2019;10(1):990.
  20. Van Nostrand EL, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods. 2016;13(6):508-514.
  21. Van Nostrand EL, et al. A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins. Nature. 2020;583(7818):711-719.
  22. Dun MD, Aitken RJ, Nixon B. The role of molecular chaperones in spermatogenesis and the post-testicular maturation of mammalian spermatozoa. Hum Reprod Update. 2012;18(4):420-435.
  23. Urdaneta EC, Beckmann BM. Fast and unbiased purification of RNA-protein complexes after UV cross-linking. Methods. 2020;178:72-82.
  24. Greenberg JR. Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):715-732.
  25. Rinn JL, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 2007;129(7):1311-1323.
  26. Clemson CM, et al. An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles. Mol Cell. 2009;33(6):717-726.
  27. Chen H, et al. Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics. Cell Rep. 2021;37(5):109915.
  28. Hafner M, et al. CLIP and complementary methods. Nat Rev Methods Primers. 2021;1(1):20.
  29. Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Methods to study RNA-protein interactions. Nat Methods. 2019;16(3):225-234.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233Tug1RNA RBPeCLIPUV

מאמרים קשורים